هذا البروتوكول ضروري لتقييم الأدوار المختلفة للعناصر الكيميائية الحيوية المحددة في النواة والسيتوبلازم وتحليل التفاعلات داخل الخلايا بين هذه المجالات داخل خطوط الخلايا المختلفة. تستخدم هذه التقنية معدات وكواشف معملية شائعة لفصل الأجزاء السيتوبلازمية والنووية بشكل أكثر كفاءة. يمكن لهذا البروتوكول القيام بذلك بتكلفة أقل وأسرع من البروتوكولات الأخرى.
مع انتشار الدراسات حول التفاعلات السيتوبلازمية والنووية على نطاق واسع ، يمكن فهم تأثير التوطين على الأحداث داخل الخلايا بشكل أفضل. يمكن تحليل التبادل بين السيتوبلازم والنواة ، مما يشير إلى ما إذا كانت جزيئات معينة خلال هذه التبادلات يمكن أن تؤدي إلى تطور السرطان ، كما أشارت الدراسات التي أجريت على البروتينات النووية. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تعديل تركيز المخزن المؤقت للتحلل إلى تركيز مناسب.
نظرا لأن استخدام المخزن المؤقت للتحلل يعتمد إلى حد كبير على تعطيل أغشية الخلايا وهناك متغيرات طبيعية في فعالية المخزن المؤقت للتحلل على خطوط الخلايا المختلفة. للبدء ، قم بإذابة الخلايا ، باستخدام أنابيب 1.5 ملليلتر عبر الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 2000 G.تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة شفط. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من محلول التحلل البارد المثلج.
ثم قم بتدوير الأنابيب بسرعة حوالي 12،000 جم عند أربع درجات سلزية لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. الحبيبات المتبقية ستكون الجزء النووي.
بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الثلج البارد PBS إلى الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. لتأكيد فصل المقصورات باستخدام qPCR ، أولا ، قم بتحويل الحمض النووي الريبي إلى حمض نووي مجاني باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا. تحضير مزيج النسخ العكسي الرئيسي.
إضافة قالب الحمض النووي الريبي. احتضان ردود الفعل في دورة حرارية. المضي قدما في إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي والتحليل.
ابدأ بتخفيف تخليق cDNA بماء DEPC للحصول على تركيز نهائي يبلغ 20 نانوجرام لكل ملليلتر. باستخدام مزيج رئيسي PCR ، قم بإعداد التفاعل لكل عينة باستخدام التعليمات اليدوية. الحصول على المجسات التجارية اللازمة للكشف عن التجزئة السيتوبلازمية والنووية.
استخدم MALAT1 كعلامة نووية و TUG1 كعلامة السيتوبلازمية. احسب حجم كل مكون بضرب كل مكون في ثلاثة لكل من النسخ المتماثلة التقنية للعينة الفردية. لكل عينة نووية وسيتوبلازمية ، احصل على المزيج النووي مع MALAT1 ، والجزء السيتوبلازمي مع MALAT1 ، والجزء النووي مع TUG1 ، والكسر السيتوبلازمي مع TUG1.
دوامة لفترة وجيزة لخلط المحاليل ونقل 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من لوحة التفاعل البصري. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف يستخدم في qPCR وأجهزة الطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة للتخلص من فقاعات الهواء ، ثم قم بتدوير العينة لأسفل عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام برنامج التصميم والتحليل ، حدد المنحنى القياسي لمعلمات ركوب الدراجات.
باستخدام برنامج qPCR، حدد تشغيل الإعداد. في صفحة خصائص ملف البيانات، حدد معلمات الأسلوب ودورة الإدخال. بعد إدخال معلمات الدورة ، حدد علامة تبويب اللوحة وأدخل العينات المراد تشغيلها.
حدد بدء التشغيل. بعد اكتمال التشغيل، قم بإنشاء جدول بيانات مع اسم العينة واسم الهدف ودورة القياس الكمي. ابدأ بعينات MALAT1 لحساب الكسر النووي.
اطرح الكسر السيتوبلازمي MALAT1 من الجزء النووي MALAT1. استمر في عينات MALAT1 لحساب الكسر السيتوبلازمي. اطرح الكسر النووي MALAT1 من الكسر السيتوبلازمي MALAT1 ثم احسب الاثنين المرفوعين إلى سالب دلتا CQ. قم بإجراء العمليات الحسابية باستخدام عينات TUG1.
عندما يكون TUG1 موجودا كعنصر تحكم إيجابي للعناصر السيتوبلازمية ، من المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية. نتيجة سلبية حيث لوحظت مستويات التجزئة السيتوبلازمية في العينة مع MALAT1. يشير هذا إلى تلوث الحمض النووي الريبي المعزول من الجزء النووي ، ربما بسبب تركيزات التحلل المنخفضة جدا أو المرتفعة جدا.
أظهر MALAT1 و TUG1 أعلى ارتباط مع الفصل النووي والسيتوبلازمي كما تم تأكيده من خلال اللطخة الغربية والرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي ، مما أكد نقاء وجودة العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إثبات نقاء المستخلصات النووية والسيتوبلازمية من خلال لطخة غربية تستخدم lamin كعلامة للكسر النووي وألفا توبولين كعلامة موجبة للجزء السيتوبلازمي. لم يلاحظ أي ذروة في الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، مما يدل على جودة عالية وتلوث ضئيل أو معدوم في عينة الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي.
يعد استخدام المخزن المؤقت للتحلل أمرا بالغ الأهمية للتجزئة المناسبة وتحسين تركيز المخزن المؤقت للتحلل إلى خط اهتمام الخلية المطلوب أمر ضروري. تسمح هذه التقنية بالدراسة المستهدفة للتفاعل النووي والسيتوبلازمي ، والتي تنطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من مواضيع البحث وتسمح بفهم أفضل لكيفية ارتباط توطين عناصر بيولوجية محددة بوظيفتها.
