RNAs غير متكد غالبا ما يكون isoforms متعددة. في دراسات فرط التعبير في المختبر ، غالبا ما يكون من الصعب دراسة كل هذه isoforms أعرب. هذه التقنية تسمح للمستخدمين لاشتقاق التعبير مباشرة من الجينوم وتمكين الخلايا للتعبير عن isoforms الذاتية لرنا غير متكود معين.
هذه التقنية القوية تسمح للمستخدم بتوجيه التعبير عن أي جين في الجينوم بدقة ودقة. من خلال تصميم RNAs دليل لجينات محددة، واحد هو قادر على استخدام آلة الربط الجينية الذاتية للتعبير عن isoforms الطبيعية في خلية معينة. إثبات الإجراء سيكون روبرت رانكين، طبيب ما بعد الطبيب من مختبري.
لتصميم تسلسل RNA الدليل الذي يقع ضمن أزواج قاعدة 100 من موقع بدء النسخ، واستخدام قواعد البيانات الجينية مثل BLAT للتأكد من أن RNA دليل فريدة من نوعها لجين من الفائدة. تخزين الجيش الملكي النيبالي الدليل وتعطيلها Cas9 plasmids في أربع درجات مئوية. خط خارج E.coli على لوحة مرق لوريا أجار مع الأمبيسيلين وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، اختر مستعمرة وتنمو البكتيريا في خمسة ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين بين عشية وضحاها ، وهز بقوة الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة مليلترين من البكتيريا إلى 200 ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين في قارورة سعة لترين، يهز بقوة القارورة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. تدور أسفل البكتيريا في 3، 724 مرات ز لمدة 20 دقيقة والمضي قدما في تنقية الحمض النووي.
لإنشاء فيروس العدس dCas9 التي تحتوي على, معطف أول 100 ملليلتر الأنسجة الأطباق ثقافة مع خمسة ملليلتر من 0.01٪ بولي-L-ليسين ولوحة خمسة ملايين HEK293T الخلايا في طبق في 10 ملليلتر كاملة من النسور المعدلة كاملة من النسور المتوسطة, ثم إعداد عينات نقل الحمض النووي عن طريق خلط 10 ميكروغرام من ناقل RNA دليل يحتوي على LTR أو ناقل Cas9 المعطلة التي تحتوي على LTR مع plasmids تحتوي على مكونات الفيروسات. يضاف الماء إلى حجم إجمالي قدره 450 ميكرولترات وتصفية الخليط من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون تعلق على حقنة. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولترات من 2.5-2-المولر كلوريد الكالسيوم لكل عينة من الحمض النووي ومزيج بلطف.
قم بتصفية خليط الكالسيوم والحمض النووي من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون متصل بحقنة. Pipette 500 ميكرولترات من 2X HBS في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر. إضافة 500 ميكرولترات من الكالسيوم والحمض النووي خليط قطرة ودوامة بلطف.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الحمض النووي والكالسيوم HBS لكل طبق ثقافة الأنسجة المحتوية على HEK293T واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث، قم بإزالة وسائل الإعلام ببطء وتجاهلها من الأطباق.
غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة ستة ملليلتر من DMEM كاملة تكملها HEPES 20 ملليمولار و 10 ملليمولار بتيرات الصوديوم. ثم احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات.
بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة وإضافة خمسة ملليلتر من DMEM كاملة مع HEPES 20 ملليمولار إلى خلايا HEK293T. احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. في اليوم الرابع، جمع عظمى خلية HEK293T وتصفية عظمى تحتوي على الفيروس.
للبدء في عدد الجسيمات الفيروسية، قم أولاً بتخفيف تركيز الغسيل من مجموعة P24 ELISA عن طريق إضافة 19 جزءًا من الماء المقطر والمأين. ثم، تمييع السيطرة الإيجابية من هذه المجموعة إلى 200 نانوغرام لكل ملليلتر باستخدام 1640 1640 1640 كما diluent وجعل التخفيفات لمنحنى القياسية في أنابيب 1.5 ملليلتر وفقا لجدول تخفيف P24 ELISA. لقياس تركيز الفيروس داخل العينات إضافة التخفيف العينة إلى الآبار المعينة من لوحة 96-جيدا، بدءا من تخفيف 1:1000 وتعديل حجم حسب الضرورة من أجل أن تكون ضمن نطاق المنحنى القياسي.
ثم تمييع العينات مع تريتون X-100 إلى تركيز نهائي من 0.5٪وإضافة 200 ميكرولترات من كل عينة و RPMI 1640 إلى الآبار المعينة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. اغسل الطبق بـ 300 ميكرولترات لكل بئر من عازل الغسيل 1X ست مرات.
إزالة أي السوائل الزائدة عن طريق عكس لوحة والاستفادة منه على منشفة ورقية. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة للكشف من عدة إلى جميع الآبار باستثناء الركازة فارغة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
اغسل الطبق ثم ازيل أي سائل زائد عن طريق عكس اللوحة والنقر عليها على منشفة ورقية. من أجل قياس الأجسام المضادة للكشف، وتمييع بيروكسيديز الفجل streptavidin في 1:100 تخفيف مع SA-HRP اللوين. اخلطي SA-HRP المخففة بدقة وأضيفي 100 ميكرولترات إلى جميع الآبار باستثناء الفارغ.
ختم واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الطبق مع المخزن المؤقت 1X والاستفادة من أي سائل زائد. إسقاط واحد تقويم العظام-phenylenediamine قرص في 11 ملليلتر من الزاوي الركيزة لجعل ما يكفي من محلول الركيزة لصفيحة واحدة.
دوامة الحل OPD بقوة لإذابته تماما وحمايته من الضوء. إضافة 100 ميكرولترات من محلول الركيزة OPD لجميع الآبار بما في ذلك فارغة. باستخدام مقياس الطيف، قراءة امتصاص في 450 نانومتر على الفور.
كرر 10 مرات على فترات ثانية واحدة واتخاذ متوسط القياس. Resuspend والثقافة Jurkat الخلايا التائية في قارورة T75 مع كثافة من مليون خلية في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام المصل انخفاض مع البوليبرين. ثم أضف HEK293T وسائل الإعلام المكيفة التي تحتوي على مليون من الجسيمات الفيروسية المحتوية على dCas9.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثلاثة أيام بعد العدوى, تدور أسفل الخلايا في 233 الوقت ز لمدة خمس دقائق و resuspend لهم في 10 ملليلتر من DMEM كاملة تكملها مع البورومايسين. ثقافة الخلايا في T75 قارورة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
كل يوم ثالث لمدة تسعة أيام، تدور أسفل الخلايا في 233 مرات ز لمدة خمس دقائق واستبدال وسائل الإعلام مع DMEM كاملة تكملها البوريميسين. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. ثم، على لوحة 96-well مع الأنسجة المعالجة ثقافة الأنسجة، إضافة 10،000 الخلايا في 100 ميكرولترات من DMEM كاملة تستكمل مع البورومايسين في البئر الأولى.
جعل 1:1 تخفيف المسلسل من محتويات الآبار التالية مع DMEM كاملة تكمل مع البوروميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. توسيع الخلايا المنعزلة إلى اثنين من لوحات 24 جيدا، ثم لوحة مليوني خلية في بئر من لوحة ستة جيدا لثلاثة من المستنسخين.
لوحة الآبار الثلاثة الأخرى مع خلايا جوركات غير مستحثة كضوابط. وأخيرا، لوحة الخلايا في قارورة T75 ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. لبدء PCR الكمي لقياس التعبير الجيني، أولا توليف الحمض النووي التكميلي عن طريق إضافة ميكروغرام واحد من الجيش الملكي النيبالي، وأربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت التوليفية cDNA، وميكر واحد من النسخ العكسي إلى 250 أنابيب ميكرولتر، ثم إضافة الماء إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر.
ثم، استخدام دورة حرارية في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإلغاء تنشيط النسخ العكسي. تمييع cDNA مع 60 ميكرولترات من الماء بعد التوليف. تشغيل تفاعل البوليميراز سلسلة من الأنابيب التي تحتوي على 0.5 ميكرولترات من كل إلى الأمام وعكس التمهيدي في التركيز النهائي من 10 ميكرومولار، وخمسة ميكرولترات من الأخضر SYBR، وأربعة ميكرولترات من cDNA.
وأخيراً حدد Jurkat-dCas9 الخلايا في DMEM تكمل مع هيغروميسين B لمدة 10 أيام. تدور أسفل الخلايا وتغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام. تنقية RNAse والمضي قدما إلى RT-qPCR.
في هذه الدراسة، تم استخدام تسلسلات GRNA التي كانت ضمن 10 إلى 100 زوج قاعدة بعيدًا عن موقع البدء النسخي لتوجيه مجمع Cas9-activating إلى مكان النسخ من IFNG-AS1، وهو رنا طويل غير متكد مرتبط بمرض الأمعاء الالتهابي. لتمكين اختيار الخلايا المستحثة المزدوجة ، تم استخدام نظام ثنائي البلازميد لتحويل إما dCas9 أو gRNAse محسنات إلى خلايا. هنا بروتينات MS2 تعزيز التعبير الزائد من IFNG-AS1.
تم تأكيد تعبير Cas9 لكل من المستنسخين. استخدمت ال التمهيديات ضد HPRT1 لتأكيد وجود الحمض النووي الريبي في الخلايا غير المستحثة. تم تأكيد التعبير مرنا عن طريق حذف نسخة عكسية من رد فعل cDNA.
ويمكن الكشف عن ثلاثة متغيرات لصق من IFNG-AS1 مع مجموعات التمهيدي نسخة محددة أو التمهيدي تعيين ضد جميع النصوص IFNG-AS1 المعروفة. وكانت جميع منحنيات الفلوريسنس أسية مع الجينات التدبير المنزلي HPRT1 الوصول إلى المرحلة الأسية في غضون دورة نصف بين التحكم والخلايا IFNG-AS1 رنا التعبير عن. كانت ال التمهيديات ضد جميع النسخ القياسية المعروفة IFNG-AS1 هي الأكثر قابلية للكشف بين التجارب، مع قياسات الزيادات 20 أضعاف في التعبير IFNG-AS1.
غير أن النص الثالث من النظام IFNG-AS1 أظهر زيادة كبيرة من خمسة إلى عشرة أضعاف في مستويات IFNG-AS1. لفرط بنشاط الجين الخاص بك المطلوب ، وتصميم RNA دليل في الخطوة 2.1 أمر بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج الجسيمات الفيروسية عالية الجودة سيضمن التعبير القوي عن مكونات البروتوكول الخاصة بك.
بمجرد أن يتم التعبير عن الجين المطلوب بشكل مفرط ، يمكن إجراء دراسات وظيفية للتحقيق في آليات الجينات. في مثالنا، اخترنا أن ننظر في إنتاج السيتوكين بعد فرط التعبير عن جيناتنا ذات الاهتمام. وقد تم تطوير هذه التقنية في البداية من قبل مجموعة غريسباخ في عام 2013 وتم تطبيقها على نطاق واسع وتفصيلها من قبل مجموعات أخرى.
كنا متحمسين لتطبيق هذه التقنية على RNAs طويلة غير مشفرة من أجل استكشاف وظائفها المحددة. يجب التعامل مع فيروسات العدسية المعيبة في المختبر الذي تمت الموافقة عليه للعمل الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر خطوط الخلايا البشرية وبكتيريا الإشريكية القولونية هي الخطر الحيوي.
وأخيرا، ينبغي أن يتم التعامل مع plasmids الحمض النووي المؤتلف من قبل الموظفين المدربين.
