يضمن بروتوكولنا كلا من صلاحية الخلية وكفاءة العزل لتعليق الخلية الواحدة بتكاليف منخفضة نسبيا. التكاليف والمتطلبات المنخفضة نسبيا لمعدات المختبرات هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية. يكشف تسلسل الخلية المفردة عن عدم تجانس الخلايا العضلية غير القلبية في الفيزيولوجيا المرضية للقلب ، كما يوفر أفكارا للدراسات الأساسية والسريرية لأمراض القلب.
يمكن استخدام هذا البروتوكول في هذه الدراسات حول بيئة القلب والأوعية الدموية بعد MI مثل مشاركة الخلايا المناعية. بالنسبة للاستعدادات لأول مرة ، أقترح إيلاء اهتمام إضافي لعينة البيبسين ووقت الهضم. بمجرد تحضير المخازن المؤقتة والمحاليل كما هو موضح في المخطوطة ، ضع فأرا تم قتله رحيما كان مصابا باحتشاء عضلة القلب قبل أسبوعين في وضع ضعيف على طاولة الجراحة.
إصلاح أطرافه الخلفية باستخدام شريط لاصق. لاستئصال القلب ، رش الجسم بنسبة 70 ٪ من الإيثانول. قم بعمل شق عمودي عبر جلد البطن والعضلات مع تجنب الكبد.
دون ثقب القلب ، افتح الصدر بعناية وغزير البطين الأيسر بمحلول PBS قبل التبريد حتى يصبح سائل التروية عديم اللون. باستخدام الملقط ، ارفع القلب برفق واقطع الأنسجة الزائدة المرتبطة بالخارج بمقص العيون. ضع القلب في ملليلتر واحد من PBS المبرد مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
نقل القلب إلى بئر من 24 صفيحة بئر موضوعة على الجليد. ماصة 150 ميكرولتر من العازلة تفكك القلب في البئر ، وقطع القلب إلى قطع بحجم ملليمتر واحد باستخدام المقص. انقل أنسجة القلب المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتفكك الأنسجة.
ضع الأنبوب في شاكر ترددي ثرموستاتي. ماصة التعليق صعودا وهبوطا 10 مرات كل 20 دقيقة. لإزالة الكتل والأنسجة غير المهضومة ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام 25 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.
شطف أنبوب الطرد المركزي ومصفاة الخلية. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة المزيد من كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة عند 300 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق عينة الخلية في خمسة مجلدات من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف أربعة مجلدات من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا في تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
في نهاية الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا. خذ 18 ميكرولترا من التعليق في أنبوب طرد مركزي آخر وأضف ميكرولتر من محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم البرتقالي الأكريدين. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول الملون إلى شريحة غرفة العد.
قم بتقييم أرقام الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد الخلايا التلقائي. لوحظت شظايا الخلايا في تعليق القلب أحادي الخلية. أدى فرز الخلايا المنشط بالتألق إلى تقليل نسبة شظايا الخلايا وتكتل الخلايا بشكل فعال مما أدى إلى انخفاض متوسط حجم الخلية.
أثبت تسلسل الحمض النووي الريبي فصلا واضحا لسبعة أنواع من الخلايا المناعية كما يتضح من التجميع غير الخاضع للإشراف وتقليل تضمين الجار العشوائي الموزع على شكل حرف T. أظهرت كل خلية مناعية تعبيرا عاليا عن العلامات الكلاسيكية. يجب قطع أنسجة القلب صغيرة بما يكفي لتجنب الهضم غير المكتمل ، مما يؤدي إلى الكثير من كتل الخلايا في تعليق الخلية.
يمكن تطبيق تعليق الخلية المفردة الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول بشكل أكبر في تحليل تدفق ثقافة الخلية الأولية. يفيد هذا البروتوكول الدراسات على البيئة المكروية لعدوى عضلة القلب ، والتي قد تساعد الباحثين على النظر إلى ما وراء أنسجة القلب والنظر في عدوى عضلة القلب كمشكلة منهجية.
