심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

당사의 프로토콜은 상대적으로 저렴한 비용으로 단일 세포 현탁액의 세포 생존력과 분리 효율성을 모두 보장합니다. 실험실 장비에 대한 상대적으로 저렴한 비용과 요구 사항이이 기술의 주요 장점입니다. 단일 세포 시퀀싱은 심장 병태생리학에서 비심근 세포의 이질성을 밝히고 심장 질환에 대한 기본 및 임상 연구에 대한 아이디어를 제공합니다.

이 프로토콜은 면역 세포의 관여와 같은 MI 후 심혈관 환경에 대한 이 연구에서 사용될 수 있습니다. 처음 준비할 때는 샘플 펩신과 소화 시간에 각별한 주의를 기울여야 한다고 제안합니다. 원고에 설명된 대로 완충액과 용액이 준비되면 2주 전에 심근경색이 있었던 안락사된 마우스를 수술대 위에 앙와위 자세로 놓습니다.

접착 테이프를 사용하여 뒷다리를 고정하십시오. 심장을 절제하려면 몸에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 간을 피하면서 복부 피부와 근육을 통해 수직 절개를하십시오.

심장에 구멍을 뚫지 않고 흉부를 조심스럽게 열고 관류액이 무색이 될 때까지 미리 냉각 된 PBS 용액으로 좌심실을 풍부하게하십시오. 집게를 사용하여 심장을 부드럽게 들어 올리고 안과 용 가위로 외부에 부착 된 과도한 조직을 잘라냅니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 1 밀리리터의 사전 냉각 된 PBS에 심장을 놓습니다.

얼음 위에 놓인 24 웰 플레이트의 우물에 심장을 옮깁니다. 150 마이크로리터의 심장 해리 완충액을 웰에 피펫하고, 가위를 사용하여 심장을 1 밀리미터 크기의 조각으로 절단하였다. 다진 심장 조직을 5 밀리리터의 조직 해리 완충액이 들어있는 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

자동 온도 조절 왕복 셰이커에 튜브를 놓습니다. 서스펜션을 20분마다 10회 위아래로 피펫합니다. 덩어리와 소화되지 않은 조직을 제거하려면 25 밀리리터의 세포 세척 완충액을 사용하여 70 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.

원심분리기 튜브와 셀 스트레이너를 헹굽니다. 다음으로, 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 추가 세포 덩어리를 제거합니다. 여과된 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리합니다.

세포 샘플을 5 부피의 RBC 용해 완충액에 재현탁하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 이제 이전에 시연된 대로 세포 현탁액과 원심분리기에 4가지 부피의 세포 세척 완충액을 추가합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 10 밀리리터의 세포 세척 완충액에 재현탁시키고 다시 한번 원심분리한다.

원심분리가 끝나면 상층액을 버리고 펠릿을 1밀리리터의 세포 세척 완충액에 재현탁합니다. 다른 원심분리기 튜브에 현탁액 18마이크로리터를 넣고 아크리딘 오렌지 프로피듐 요오드화물 염색 용액 2마이크로리터를 추가합니다. 이 염색된 용액 10마이크로리터를 계수 챔버 슬라이드에 추가합니다.

자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수와 생존력을 평가합니다. 세포 단편은 단세포 심장 현탁액에서 관찰되었다. 형광 활성화 세포 분류는 세포 단편 및 세포 응집의 비율을 효과적으로 감소시켜 평균 세포 크기를 감소시켰습니다.

RNA 시퀀싱은 감독되지 않은 클러스터링 및 감소된 T-분포 확률적 이웃 임베딩에 의해 입증된 바와 같이 7가지 유형의 면역 세포의 명백한 분리를 입증했습니다. 각 면역세포는 고전적 마커의 높은 발현을 보였다. 심장 조직은 불완전한 소화를 피하기 위해 충분히 작게 절단해야 하며, 이로 인해 세포 현탁액에 많은 세포 덩어리가 생깁니다.

이 프로토콜에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액은 일차 세포 배양의 유동 분석에 추가로 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 심근 감염의 미세 환경에 대한 연구에 도움이 되며, 이는 연구자들이 심장 조직 너머를 바라보고 심근 감염을 체계적인 문제로 간주하는 데 도움이 될 수 있습니다.