Nosso protocolo garante a viabilidade celular e a eficiência de isolamento da suspensão de célula única a custos relativamente baixos. Os custos relativamente baixos e a exigência de equipamentos laboratoriais são as principais vantagens dessa técnica. O sequenciamento unicelular revela a heterogeneidade dos não cardiomiócitos na fisiopatologia cardíaca, além de fornecer ideias para estudos básicos e clínicos para doenças cardíacas.
Esse protocolo pode ser utilizado nesses estudos sobre o ambiente cardiovascular pós-IAM, como o envolvimento de células imunes. Para preparações de primeira vez, sugiro que atenção extra deve ser dada à amostra de pepsina e tempo de digestão. Uma vez preparados os tampões e as soluções conforme descrito no manuscrito, colocar um camundongo eutanasiado que teve um infarto do miocárdio duas semanas antes em posição supina sobre a mesa cirúrgica.
Fixe os membros posteriores com fita adesiva. Para excisar o coração, borrife o corpo com etanol 70%. Faça uma incisão vertical através da pele e músculos abdominais, evitando o fígado.
Sem puncionar o coração, abra cuidadosamente o tórax e profuse o ventrículo esquerdo com solução PBS pré-resfriante até que o fluido de perfusão fique incolor. Usando pinças, levante suavemente o coração e corte o excesso de tecidos presos ao seu exterior com tesouras oftálmicas. Coloque o coração em um mililitro de PBS pré-resfriado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Transfira o coração para um poço de uma placa de 24 poços colocada no gelo. Pipetar 150 microlitros do tampão de dissociação cardíaca no poço e cortar o coração em pedaços de um milímetro usando tesoura. Transfira o tecido cardíaco picado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros do tampão de dissociação do tecido.
Coloque o tubo em um agitador alternativo termostático. Pipetar a suspensão para cima e para baixo 10 vezes a cada 20 minutos. Para remover aglomerados e tecido não digerido, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrômetros usando 25 mililitros de tampão de lavagem celular.
Enxágue o tubo da centrífuga e o filtro celular. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 micrômetros para remover mais aglomerados celulares. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Ressuspender a amostra celular em cinco volumes de tampão de lise eritrocitária e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione quatro volumes do tampão de lavagem celular em suspensão e centrífuga celular, conforme demonstrado anteriormente. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mililitros do tampão de lavagem celular e centrífuga novamente.
Ao final da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem celular. Pegue 18 microlitros da suspensão em outro tubo de centrífuga e adicione dois microlitros de solução corante de iodeto de propídio laranja acridina. Adicione 10 microlitros desta solução corada a uma lâmina da câmara de contagem.
Avalie o número de células e a viabilidade usando um contador automático de células. Fragmentos celulares foram observados na suspensão cardíaca unicelular. A classificação celular ativada por fluorescência efetivamente reduziu a proporção de fragmentos celulares e aglomeração celular, resultando na diminuição do tamanho médio das células.
O sequenciamento de RNA provou uma separação óbvia de sete tipos de células imunes, como demonstrado pelo agrupamento não supervisionado e pela incorporação reduzida de vizinhos estocásticos distribuídos por T. Cada célula imune apresentou alta expressão de marcadores clássicos. O tecido cardíaco precisa ser cortado pequeno o suficiente para evitar a digestão incompleta, o que leva a muitos nódulos celulares na suspensão celular.
A suspensão unicelular obtida por este protocolo pode ser posteriormente aplicada na análise de fluxo de cultura celular primária. Esse protocolo beneficia os estudos sobre o microambiente da infecção miocárdica, o que pode ajudar os pesquisadores a olhar além dos tecidos cardíacos e considerar a infecção miocárdica como um problema sistemático.
