Il nostro protocollo garantisce sia la vitalità della cella che l'efficienza di isolamento della sospensione a singola cellula a costi relativamente bassi. I costi relativamente bassi e i requisiti per le attrezzature di laboratorio sono i principali vantaggi di questa tecnica. Il sequenziamento a singola cellula rivela l'eterogeneità dei non cardiomiociti nella fisiopatologia cardiaca e fornisce anche idee per studi di base e clinici per le malattie cardiache.
Questo protocollo può essere utilizzato in questi studi sull'ambiente cardiovascolare post-MI come il coinvolgimento delle cellule immunitarie. Per i preparativi per la prima volta, suggerisco di prestare particolare attenzione alla pepsina campione e al tempo di digestione. Una volta che i tamponi e le soluzioni sono stati preparati come descritto nel manoscritto, posizionare un topo eutanasia che ha avuto un infarto miocardico due settimane prima in posizione supina sul tavolo chirurgico.
Fissare gli arti posteriori con del nastro adesivo. Per asportare il cuore, spruzzare il corpo con etanolo al 70%. Fai un'incisione verticale attraverso la pelle addominale e i muscoli evitando il fegato.
Senza perforare il cuore, aprire con attenzione il torace e abbondante ventricolo sinistro con una soluzione PBS pre-fredda fino a quando il fluido di perfusione non diventa incolore. Usando una pinza, sollevare delicatamente il cuore e tagliare via i tessuti in eccesso attaccati al suo esterno con forbici oftalmiche. Posizionare il cuore in un millilitro di PBS pre-raffreddato in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Trasferire il cuore in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti posta sul ghiaccio. Pipet 150 microlitri del tampone di dissociazione cardiaca nel pozzo e tagliare il cuore in pezzi di dimensioni millimetriche usando le forbici. Trasferire il tessuto cardiaco tritato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri del tampone di dissociazione tissutale.
Posizionare il tubo in uno shaker alternativo termostatico. Pipet la sospensione su e giù 10 volte ogni 20 minuti. Per rimuovere grumi e tessuto non digerito, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri utilizzando 25 millilitri di tampone di lavaggio cellulare.
Risciacquare il tubo della centrifuga e il filtro cellulare. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere ulteriori grumi di cellule. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Risospendere il campione cellulare in cinque volumi di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Ora, aggiungere quattro volumi del tampone di lavaggio cellulare nella sospensione cellulare e centrifugare come dimostrato in precedenza. Dopo aver eliminato il surnatante, risospendere le cellule in 10 millilitri del tampone di lavaggio cellulare e centrifugare nuovamente.
Al termine della centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio cellulare. Prendere 18 microlitri della sospensione in un altro tubo da centrifuga e aggiungere due microlitri di soluzione colorante di ioduro di acridina arancione propidio. Aggiungere 10 microlitri di questa soluzione macchiata in un vetrino della camera di conteggio.
Valutare il numero di celle e la vitalità utilizzando un contatore automatico delle celle. Sono stati osservati frammenti cellulari nella sospensione cardiaca monocellulare. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza ha ridotto efficacemente la proporzione dei frammenti cellulari e l'aggregazione cellulare con conseguente diminuzione delle dimensioni medie delle cellule.
Il sequenziamento dell'RNA ha dimostrato un'ovvia separazione di sette tipi di cellule immunitarie, come dimostrato dal clustering non supervisionato e dall'incorporazione stocastica ridotta del vicino distribuito a T. Ogni cellula immunitaria ha mostrato un'alta espressione di marcatori classici. Il tessuto cardiaco deve essere tagliato abbastanza piccolo da evitare una digestione incompleta, che porta a molti grumi cellulari nella sospensione cellulare.
La sospensione monocellulare ottenuta da questo protocollo può essere ulteriormente applicata nell'analisi del flusso di colture cellulari primarie. Questo protocollo avvantaggia gli studi sul microambiente dell'infezione miocardica, che possono aiutare i ricercatori a guardare oltre i tessuti cardiaci e considerare l'infezione miocardica come un problema sistematico.
