制备用于心肌梗死后成年小鼠心脏单细胞RNA测序的非心肌细胞悬液

我们的方案以相对较低的成本确保单细胞悬液的细胞活力和分离效率。相对较低的成本和对实验室设备的要求是该技术的主要优点。单细胞测序揭示了非心肌细胞在心脏病理生理学中的异质性，也为心脏病的基础和临床研究提供了思路。

该协议可用于对心肌梗死后心血管环境的研究，例如免疫细胞的参与。对于首次制备，我建议应特别注意样品胃蛋白酶和消化时间。一旦按照手稿中的描述制备缓冲液和溶液，将两周前发生心肌梗塞的安乐死小鼠仰卧在手术台上。

用胶带固定它的后肢。要切除心脏，请用70%乙醇喷洒身体。在避免肝脏的同时，通过腹部皮肤和肌肉进行垂直切口。

在不刺穿心脏的情况下，小心地打开胸部，用预冷的PBS溶液大量注入左心室，直到灌注液无色。使用镊子轻轻提起心脏，并用眼科剪刀切掉附着在其外部的多余组织。将心脏置于1.5毫升微量离心管中的一毫升预冷PBS中。

将心脏转移到放置在冰上的24孔板的孔中。将150微升心脏解离缓冲液移入孔中，并用剪刀将心脏切成一毫米大小的碎片。将切碎的心脏组织转移到含有5毫升组织解离缓冲液的15毫升离心管中。

将管子放入恒温往复摇床中。每 20 分钟上下移液悬浮液 10 次。为了去除团块和未消化的组织，使用25毫升细胞洗涤缓冲液通过70微米细胞过滤器过滤细胞悬液。

冲洗离心管和细胞过滤器。接下来，通过40微米的细胞过滤器过滤细胞悬液以去除更多的细胞团块。将过滤后的细胞悬液在 300 x g 下在 4 摄氏度下离心五分钟。

将细胞样品重悬于五体积的RBC裂解缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。现在，如前所述，在细胞悬液和离心机中加入四体积的细胞洗涤缓冲液。弃去上清液后，将细胞重悬于10毫升细胞洗涤缓冲液中，并再次离心。

在离心结束时，弃去上清液并将沉淀重悬于一毫升细胞洗涤缓冲液中。取18微升悬浮液在另一个离心管中，加入两微升吖啶橙碘化丙啶染色溶液。将10微升该染色溶液添加到计数室载玻片中。

使用自动细胞计数器评估细胞数量和活力。在单细胞心脏悬液中观察到细胞碎片。荧光活化细胞分选有效地降低了细胞片段的比例和细胞聚集，从而减小了平均细胞大小。

RNA测序证明了七种类型的免疫细胞的明显分离，如无监督聚类和减少的T分布随机邻居嵌入所证明的那样。每个免疫细胞都显示出经典标志物的高表达。心脏组织需要切得足够小，以避免消化不完全，这会导致细胞悬液中出现大量细胞块。

通过该方案获得的单细胞悬液可以进一步应用于原代细胞培养物的流动分析。该协议有利于对心肌感染微环境的研究，这可能有助于研究人员超越心脏组织，将心肌感染视为一个系统性问题。