Unser Protokoll gewährleistet sowohl die Zellviabilität als auch die Isolationseffizienz von Einzelzellsuspensionen zu relativ geringen Kosten. Die relativ geringen Kosten und Anforderungen an die Laborausstattung sind die Hauptvorteile dieser Technik. Die Einzelzellsequenzierung zeigt die Heterogenität von Nicht-Kardiomyozyten in der kardialen Pathophysiologie auf und liefert auch Ideen für grundlegende und klinische Studien zu Herzerkrankungen.
Dieses Protokoll kann in diesen Studien über das kardiovaskuläre Milieu nach einem Myokardinfarkt, wie z. B. die Beteiligung von Immunzellen, verwendet werden. Bei der erstmaligen Zubereitung schlage ich vor, besonders auf das Pepsin der Probe und die Verdauungszeit zu achten. Sobald die Puffer und Lösungen wie im Manuskript beschrieben vorbereitet sind, legen Sie eine euthanasierte Maus, die zwei Wochen zuvor einen Myokardinfarkt erlitten hatte, in Rückenlage auf den Operationstisch.
Fixieren Sie die Hinterbeine mit Klebeband. Um das Herz zu entfernen, besprühen Sie den Körper mit 70%igem Ethanol. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Bauchhaut und die Muskeln, während Sie die Leber aussparen.
Ohne das Herz zu punktieren, öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb und füllen Sie die linke Herzkammer mit vorgekühlter PBS-Lösung, bis die Perfusionsflüssigkeit farblos läuft. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette sanft an und schneiden Sie das überschüssige Gewebe, das an seiner Außenseite befestigt ist, mit einer Augenschere ab. Legen Sie das Herz in einen Milliliter vorgekühltes PBS in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Übertragen Sie das Herz in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die auf Eis gestellt wird. Pipettieren Sie 150 Mikroliter des kardialen Dissoziationspuffers in die Vertiefung und schneiden Sie das Herz mit einer Schere in einen Millimeter große Stücke. Das gehackte Herzgewebe wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das fünf Milliliter des Gewebedissoziationspuffers enthält.
Legen Sie das Röhrchen in einen thermostatischen Schüttler. Pipettieren Sie die Aufhängung alle 20 Minuten 10 Mal auf und ab. Um Klumpen und unverdautes Gewebe zu entfernen, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb mit 25 Millilitern Zellwaschpuffer.
Spülen Sie das Zentrifugenröhrchen und das Zellensieb aus. Als nächstes filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um weitere Zellklumpen zu entfernen. Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Resuspendieren Sie die Zellprobe in fünf Volumina Erythrozytenlysepuffer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie nun vier Volumina des Zellwaschpuffers in Zellsuspension hinzu und zentrifugieren Sie, wie zuvor gezeigt. Nach dem Entsorgen des Überstandes werden die Zellen in 10 Milliliter des Zellwaschpuffers resuspendiert und erneut zentrifugiert.
Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in einem Milliliter Zellwaschpuffer resuspendiert. Nehmen Sie 18 Mikroliter der Suspension in ein anderes Zentrifugenröhrchen und fügen Sie zwei Mikroliter Acridin-Orangen-Propidiumiodid-Färbelösung hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter dieser gefärbten Lösung in einen Objektträger der Zählkammer.
Bewerten Sie die Zellzahlen und die Viabilität mit einem automatischen Zellzähler. Zellfragmente wurden in der einzelligen kardialen Suspension beobachtet. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung reduzierte effektiv den Anteil der Zellfragmente und die Zellverklumpung, was zu einer verringerten durchschnittlichen Zellgröße führte.
Die RNA-Sequenzierung bewies eine offensichtliche Trennung von sieben Arten von Immunzellen, was durch das unüberwachte Clustering und die reduzierte T-verteilte stochastische Einbettung von Nachbarn gezeigt wurde. Jede Immunzelle zeigte eine hohe Expression klassischer Marker. Das Herzgewebe muss klein genug geschnitten werden, um eine unvollständige Verdauung zu vermeiden, die zu vielen Zellklumpen in der Zellsuspension führt.
Die durch dieses Protokoll erhaltene Einzelzellsuspension kann in der Flussanalyse von primären Zellkulturen weiter angewendet werden. Dieses Protokoll kommt den Studien über die Mikroumgebung der Myokardinfektion zugute, die den Forschern helfen können, über das Herzgewebe hinauszublicken und die Myokardinfektion als systematisches Problem zu betrachten.
