يسلط هذا البروتوكول الضوء على أهمية البيئة المكروية للورم في تنشيط الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان أو CAF. يمكن أن يكون نموذجا ممتازا في المختبر لدراسة خصائص النمط الظاهري. تكمن القيود الرئيسية في بيولوجيا CAF في التوافر المحدود ل CAF من عينات خزعة الورم الأولية.
لذلك يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة جوانب مختلفة من بيولوجيا CAF. تصور هذه الدراسة الإنتاج المتقاطع الشاذ واختلال الميتوكوندريا المرتبط بتنشيط CAF مما يؤدي إلى سوء تشخيص الورم. سيكون تطبيق هذه الطريقة مفيدا لتقييم تفاعلات صدمة الورم وخاصة تنشيط CAF وصحة الميتوكوندريا.
من أجل استكشاف أهداف المخدرات الجديدة. يجب أن يكون لدى الأفراد خبرة في إجراء الخلية قبل تنفيذ هذه التقنية. سيسمح العرض المرئي لهذه التقنية بفهم الخطوات الحاسمة في عزل سكان CAF عن كرويات الورم والتطبيقات النهائية لدراسة بيولوجيا CAF.
تقوم الآنسة لينا أرورا والآنسة موينا كاليا والسيدة سومياجيت روي ، مساعدو مختبري بإجراء التجارب. للبدء في نمو سرطان الرئة الغدي البشري A549 والخلايا الملتصقة بالخلايا الليفية الرئوية البشرية MRC-5 في DMEM وخلايا وحيدات بشرية THP-1 في RPMI ، يكتمل متوسط النمو في قوارير T25 عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاثة أيام ، عند التقاء الخلايا بنسبة 80 إلى 85٪ ، اغسل خلايا A549 و MRC-5 بملليلتر واحد من PBS لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، احصد الخلايا عن طريق احتضانها ب 500 ميكرولتر من محلول 0.25٪ تربسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم أضف على الفور أربعة ملليلتر من وسط النمو الكامل لتعطيل التربسين.
اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلتر وقم بتكبيله عند 125 × جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو كامل سعة خمسة ملليلتر. لإنشاء كرويات الورم متعددة الخلايا ، عد أرقام الخلايا A549 و MRC-5 و THP-1 باستخدام عداد خلايا لحجم ملليلتر واحد.
بعد العد ، قم بإعداد تعليق الخلية بنسبة 5: 4: 1 وقم بتكوين الحجم إلى ملليلتر واحد باستخدام DMEM الكامل. بعد ذلك ، ضع قطرة من 25 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية على غطاء طبق ثقافة 90 ملم. املأ قاع الطبق ب 10 ملليلتر من الماء المعقم.
اقلب الغطاء بعناية فوق غرفة الترطيب المملوءة بالماء وضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الرابع ، راقب الأجسام الكروية تحت المجهر. للحصول على الصور ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة.
ضع طبق الاستزراع 90 ملم على المسرح وحدد التكبير 10 ×. اضبط العدسات وافحص الخلايا لتحليل تجمع الخلايا وتكاثرها. اضغط على زري التجميد والحفظ المتوفرين لالتقاط الصورة.
بعد التصوير ، استبدل وسط النمو عن طريق استنشاق 20 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل قطرة بوسط جديد. للتصوير الحي الميت ، قم بتشغيل Ctr المتقدم ، وهو التبديل الأول ، ثم وحدة المعالجة المركزية وانتظر حتى يتم تمهيد نظام البرنامج. عند التمهيد ، ضع طبق 90 ملم الذي يحتوي على كرويات على مرحلة المجهر الفلوري المقلوب.
ثم راقب الصور والتقطها بتكبير 10 أضعاف عن طريق تحديد خيار التألق في البرنامج وتحديد FITC لقناة الكالسين وتكساس الحمراء. بعد ذلك ، حدد الخيار ، مباشرة وعرض الصورة. اضبط شدة التألق من أجل التحسين المناسب وانقر فوق الزر الآمن.
اجمع 200 ورم ، كرويات كل يوم في اليوم السابع و 10 باستخدام ماصة ملليلتر واحد وأنبوب 15 ملليلتر. ثم بيليه كروية عن طريق الطرد المركزي في 125 × ز لمدة خمس دقائق واستنشاق بعناية طاف . اغسل الكرويات ب 200 ميكرولتر من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية.
أضف 400 ميكرولتر من محلول EDTA 0.25٪ من التربسين لتفكك كروي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أداء ماصة قوية للتفكك الكامل للكرويات. تحييد التربسين عن طريق إضافة ملليلتر واحد من وسط نمو DMEM الكامل.
ثم قم بالطرد المركزي للتعليق الكروي وتخلص من المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط DMEM الكامل. احسب العدد الإجمالي للخلايا كما هو موضح. لعزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان أو CAFs من الأجسام الكروية للورم ، أعد تعليق 1 × 10 إلى الخلايا السابعة في 80 ميكرولتر من فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية الباردة أو المخزن المؤقت MACS.
أضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية إلى تعليق الخلية ، واخلطها جيدا عن طريق النقر برفق على الأنبوب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت البارد MACS. ثم قم بالطرد المركزي واستنشاق المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
لفصل الخلايا القائمة على الخرزة المغناطيسية ، قم بإعداد عمود MACS عن طريق شطفه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. ضع معلق الخلية في العمود واجمع التدفق من خلال احتواء عدد الخلايا غير المصنف. بعد ذلك ، اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS قبل إزالته من الفاصل.
ثم ضع العمود على أنبوب التجميع. اجمع الخلايا الموسومة بالميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS ودفع المكبس بقوة إلى العمود. قم بالطرد المركزي للخلايا المصنفة قبل المتابعة للتطبيقات النهائية.
احسب عدد CAFs المعزولة واستخدم ما يقرب من 6 × 10 للخلايا الرابعة لتحليل قياس التدفق الخلوي. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم قم بالطرد المركزي واستنشاق المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا واحتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوامة متقطعة للحفاظ على تعليق خلية واحدة.
مرة أخرى ، بعد الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للنفاذية ، أضف ميكرولترين من الجسم المضاد ل APC المضاد ل SMA المضاد للإنسان واحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للنفاذية وأجهزة الطرد المركزي لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. أعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية لقياس التدفق الخلوي.
حدد الخلايا الموجبة ACTA2 بعد التمييز بين مجموعات الخلايا بناء على تشتتها الأمامي والجانبي. تحديد السكان المفرد متبوعا باختيار الخلايا الموجبة ACTA2 التي تظهر كقمة واحدة على الرسم البياني للمعلمة المفردة. يظهر هنا تطور كرويات الورم متعدد الخلايا وتحليل الأحياء الميتين.
في اليوم السابع ، كانت الأجسام الكروية مضغوطة وصلبة بقطر حوالي 260 ميكرون. في اليوم 10 ، كان قطر الأجسام الكروية 480 ميكرون. في مقايسة صلاحية الخلية ، لوحظ انخفاض في مضان يوديد البروبيديوم وزيادة في مضان الكالسيين-AM من اليوم السابع إلى اليوم 10.
كشف تلطيخ نقص الأكسجين عن نواة نقص الأكسجين في وسط اليوم 10 كروية. علاوة على ذلك ، لوحظ تنظيم التعبير الجيني E-cadherin و Mki-67 مع زيادة أيام تكوين الورم الكروي. كانت CAFs المعزولة من كرويات الورم في اليوم 10 إيجابية بنسبة 69٪ تقريبا ACTA2.
أظهرت CAFs ثلاثة أضعاف في ACTA2 وعشرة أضعاف في سلسلة الكولاجين من النوع 1 ألفا 2 مقارنة بالخلايا الليفية MRC-5. لوحظت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في اليوم 10 من الأورام الكروية مقارنة باليوم السابع ، مما يشير إلى احتمال مشاركة جيل ROS في تنشيط CAF. لوحظت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية في CAFs ، معزولة من اليوم السابع واليوم 10 من الأورام الكروية.
علاوة على ذلك ، شوهد تغيير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ JC-1. لوحظ تحريض التعبير الجيني GLUT1 و MCT4 في CAFs مقارنة بالخلايا الليفية الطبيعية. لوحظ تحريض كبير لنازعة هيدروجين اللاكتات وأوكسيديز السيتوكروم سي ونشاط إنزيم نازعة هيدروجين السكسينات في CAFs مقارنة بالخلايا الليفية العادية.
يجب استخدام نسبة 5: 4: 1 من خلايا A549 و MRC-5 و THP-1 للتطوير الناجح للورم الكروي متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد. يعتبر عدد الخلايا الليفية أمرا بالغ الأهمية لصلابة الأجسام الكروية الورمية. على غرار محلول الكاتيون والتوصيف ، يمكن للمرء أيضا استخدام هذا الورم الكروي للحصول على عدد خلايا البلاعم المرتبطة بالورم ، وهو شريك في تطور الورم.
سيساعدنا هذا التحليل الكروي على فهم كيفية مشاركة الخلايا السرطانية المتقاطعة في تنشيط CAFs ، ويمكن استخدامه أيضا للتحقق من الأدوية المرشحة الخاصة بالميتوكوندريا.
