Этот протокол подчеркивает важность микроокружения опухоли в активации связанных с раком фибробластов или CAF. Это может быть отличная модель in vitro для изучения фенотипических характеристик. Основные ограничения в биологии CAF заключаются в ограниченной доступности CAF из образцов первичной биопсии опухоли.
Таким образом, этот метод может быть использован для изучения различных аспектов биологии CAF. Это исследование изображает аберрантное перекрестное производство и митохондриальную дисфункцию, связанную с активацией CAF, что приводит к плохому прогнозу опухоли. Применение этого метода было бы полезно для оценки травматических взаимодействий опухоли, особенно активации CAF и здоровья митохондрий.
Для того, чтобы исследовать новые лекарственные мишени. Люди должны иметь опыт в клеточной процедуре, прежде чем выполнять эту технику. Визуальная демонстрация этого метода позволит понять критические шаги в изоляции популяции CAF от сфероидов опухоли и последующих приложений для изучения биологии CAF.
Мисс Лина Арора, мисс Мойна Калия и миссис Сумьяджит Рой, ассистенты моей лаборатории, проводят эксперименты. Для начала роста аденокарциномы легкого человека А549 и адгезивных клеток фибробластов легкого человека MRC-5 в DMEM и моноцитов человека THP-1 в RPMI полная среда роста в колбах T25 при 37 градусах Цельсия в увлажненной камере с 5% углекислым газом.
Через три дня, при слиянии клеток от 80 до 85%, промыть клетки A549 и MRC-5 одним миллилитром PBS в течение одной минуты. Затем соберите клетки, инкубируя их с 500 микролитрами 0,25% раствора трипсина ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Затем сразу же добавляют четыре миллилитра полной питательной среды, чтобы инактивировать трипсин.
Соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку и гранулируйте ее при 125 х г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в пятимиллилитровой полной питательной среде. Чтобы установить многоклеточные сфероиды опухолей, подсчитайте номера клеток A549, MRC-5 и THP-1 с помощью счетчика клеток для одного миллилитра объема.
После подсчета подготовьте клеточную суспензию в соотношении 5:4:1 и восполните объем до одного миллилитра с полным DMEM. Затем поместите каплю из 25 микролитров клеточной суспензионной смеси на крышку 90-миллиметровой чашки для культивирования. Наполните дно блюда 10 миллилитрами стерильной воды.
Осторожно переверните крышку над заполненной водой гидратационной камерой и поместите чашку в инкубатор клеточных культур на три дня. На четвертый день следите за сфероидами под микроскопом. Для получения изображений включите выключатель питания.
Поместите 90-миллиметровую культурную чашку на сцену и выберите 10-кратное увеличение. Отрегулируйте линзы и исследуйте клетки, чтобы проанализировать агрегацию и пролиферацию клеток. Нажмите кнопки зависания и сохранения, предоставленные для захвата изображения.
После визуализации замените питательную среду, тщательно аспирируя 20 микролитров среды из каждой капли свежей средой. Для создания образов в реальном времени включите Ctr advanced, который является переключением одного, затем процессора и дождитесь загрузки программной системы. После загрузки поместите 90-миллиметровую тарелку, содержащую сфероиды, на сцену перевернутого флуоресцентного микроскопа.
Затем наблюдайте и захватывайте изображения с 10-кратным увеличением, выбрав опцию флуоресценции в программном обеспечении и выбрав FITC для кальцеина и канала Texas Red. Далее выберите опцию, живите и просматривайте изображение. Отрегулируйте интенсивность флуоресценции для соответствующей оптимизации и нажмите безопасную кнопку.
Соберите 200 опухолей, сфероидов каждая на седьмой и 10-й день, используя одну миллилитровую пипетку и 15-миллилитровую трубку. Затем гранулируют сфероиды центрифугированием при 125 х г в течение пяти минут и осторожно аспирируют супернатант. Вымойте сфероиды 200 микролитрами PBS, снова центрифугируйте и выбросьте супернатант.
Добавьте 400 микролитров 0,25% раствора трипсина ЭДТА для распада сфероидов и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Выполняют энергичное пипетирование для полного распада сфероидов. Нейтрализуют трипсин, добавив один миллилитр полной питательной среды DMEM.
Затем центрифугируют сфероидную суспензию и выбрасывают супернатант перед повторным использованием гранулы в одном миллилитре полной среды DMEM. Подсчитайте общее количество ячеек, как показано на рисунке. Для выделения связанных с раком фибробластов или ЦАФ из сфероидов опухоли повторно суспендируют 1 х 10 к седьмым клеткам в 80 микролитрах холодной магнитно-активированной сортировки клеток или буфера MACS.
Добавьте в клеточную суспензию 20 микролитров антифибробластных микрогранул, хорошо перемешайте, осторожно постукивая по трубке и инкубируя ее при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации промыть клетки одним миллилитром холодного буфера MACS. Затем центрифугируют и аспирируют супернатант перед повторным использованием гранулы в 500 микролитрах буфера MACS.
Для разделения клеток на магнитной основе шариков подготовьте колонну MACS, промыв ее тремя миллилитрами буфера MACS. Поместите клеточную суспензию в колонну и соберите поток, содержащий немаркированную клеточную популяцию. Затем трижды промыть колонну тремя миллилитрами буфера MACS перед извлечением ее из сепаратора.
Затем поместите колонну на коллекционную трубку. Соберите клетки, меченые микрогранулами антифибробластов, добавив пять миллилитров буфера MACS и прочно протолкнув плунжер в колонну. Центрифугируйте меченые ячейки, прежде чем приступать к последующим применениям.
Подсчитайте количество изолированных КАФ и используйте приблизительно от 6 х 10 до четвертой клетки для анализа проточной цитометрии. Промыть клетки один раз PBS, затем центрифугировать и аспирировать супернатант. Затем добавьте 100 микролитров буфера пермеабилизации клеток и инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут с прерывистым вихрем для поддержания одноклеточной суспензии.
Опять же, после центрифугирования и повторного использования клеток в буфере пермеабилизации, добавьте два микролитра конъюгированного античеловеческого альфа-антитела SMA и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут. После инкубации добавляют один миллилитр буфера пермеабилизации и центрифугу для удаления избытка антител. Повторное суспендирование гранул в 400 микролитрах буфера пермеабилизации для проточной цитометрии.
Выберите положительные клетки ACTA2 после различения популяций клеток на основе их прямого и бокового рассеяния. Выбор синглетической популяции с последующим выбором положительных клеток ACTA2, которые отображаются как один пик на гистограмме с одним параметром. Здесь показано развитие сфероидов многоклеточных опухолей и живо-мертвый анализ.
На седьмой день сфероиды были компактными и жесткими с диаметром около 260 микрон. На 10-й день сфероиды были 480 микрон в диаметре. В анализе жизнеспособности клеток наблюдалось снижение флуоресценции йодида пропидия и увеличение флуоресценции кальциина-АМ с седьмого дня до 10-го дня.
Гипоксическое окрашивание выявило гипоксическое ядро в центре дня 10 сфероидов. Кроме того, наблюдалось повышение регуляции экспрессии генов E-кадгерина и Mki-67 с увеличением в дни образования сфероидов опухоли. CAF, выделенные с 10-го дня сфероидов опухоли, были примерно на 69% положительными в ACTA2.
CAF показали трехкратное повышение регуляции в ACTA2 и десятикратное в цепи коллагена типа 1 альфа 2 по сравнению с фибробластами MRC-5. Наблюдалось значительное повышение уровня АФК на 10-й день сфероидов опухоли по сравнению с седьмым днем, что свидетельствует о возможном участии генерации АФК в активации CAF. Наблюдалось значительное повышение клеточных уровней АФК в ЦАФ, выделенных с седьмого и 10-го дней сфероидов опухолей.
Более того, изменение потенциала митохондриальной мембраны было замечено при окрашивании JC-1. Индукция экспрессии генов GLUT1 и MCT4 наблюдалась в ЦАФ по сравнению с нормальными фибробластами. В КАФ наблюдалась значительная индукция активности лактатдегидрогеназы, цитохром С-оксидазы и фермента сукцинатдегидрогеназы по сравнению с нормальными фибробластами.
Соотношение 5:4:1 клеток A549, MRC-5 и THP-1 должно быть использовано для успешной разработки 3D-многоклеточного сфероида опухоли. Популяция фибробластов имеет решающее значение для жесткости сфероидов опухоли. Подобно катионному раствору и характеристике, можно также использовать этот сфероид опухоли для получения популяции клеток макрофагов, ассоциированных с опухолью, которая является соучастником прогрессирования опухоли.
Этот сфероидный анализ поможет нам понять, как раковые клетки, скрещенные фибробластами, участвуют в активации CAF, а также могут быть использованы для проверки митохондриальных специфических кандидатов на лекарства.
