Dieses Protokoll unterstreicht die Bedeutung der Tumormikroumgebung bei der Aktivierung der krebsassoziierten Fibroblasten oder CAF. Es könnte ein hervorragendes In-vitro-Modell sein, um phänotypische Merkmale zu untersuchen. Die Haupteinschränkungen in der CAF-Biologie liegen in der begrenzten Verfügbarkeit von CAF aus primären Tumorbiopsieproben.
So kann diese Technik verwendet werden, um verschiedene Aspekte der CAF-Biologie zu untersuchen. Diese Studie zeigt eine anomale Kreuzproduktion und mitochondriale Dysfunktion im Zusammenhang mit einer CAF-Aktivierung, die zu einer schlechten Tumorprognose führt. Die Anwendung dieser Methode wäre nützlich, um die Trauma-Interaktionen des Tumors zu beurteilen, insbesondere die CAF-Aktivierung und die mitochondriale Gesundheit.
Um die neuartigen Wirkstoffziele zu erforschen. Einzelpersonen müssen Erfahrung in der Zellprozedur haben, bevor sie diese Technik durchführen. Die visuelle Demonstration dieser Technik wird es ermöglichen, die kritischen Schritte bei der Isolierung der CAF-Population aus den Tumor-Sphäroiden und nachgelagerten Anwendungen zur Untersuchung der CAF-Biologie zu verstehen.
Fräulein Leena Arora, Fräulein Moyna Kalia und Frau Soumyajit Roy, Assistentinnen meines Labors, führen die Experimente durch. Um das menschliche Lungenadenokarzinom A549 und den menschlichen Lungenfibroblasten MRC-5 adhärente Zellen in DMEM und menschliche Monozyten THP-1-Zellen in RPMI zu züchten, bilden sie ein vollständiges Wachstumsmedium in T25-Flaschen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer mit 5% Kohlendioxid.
Nach drei Tagen, bei 80 bis 85% Zellkonfluenz, waschen Sie die A549- und MRC-5-Zellen eine Minute lang mit einem Milliliter PBS. Als nächstes ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit 500 Mikrolitern 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie dann sofort vier Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.
Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie bei 125 x g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem fünf Milliliter vollständigen Wachstumsmedium. Um mehrzellige Tumorsphäroide zu bestimmen, zählen Sie die Zellzahlen A549, MRC-5 und THP-1 mit einem Zellzähler für ein Millilitervolumen.
Nach dem Zählen wird die Zellsuspension im Verhältnis 5:4:1 vorbereitet und das Volumen mit vollständigem DMEM auf einen Milliliter aufgefüllt. Als nächstes geben Sie einen Tropfen von 25 Mikrolitern Zellsuspensionsmischung auf den Deckel einer 90-Millimeter-Kulturschale. Füllen Sie den Boden der Schüssel mit 10 Milliliter sterilem Wasser.
Drehen Sie den Deckel vorsichtig über die mit Wasser gefüllte Trinkkammer und stellen Sie die Schale für drei Tage in einen Zellkultur-Inkubator. Überwachen Sie am vierten Tag die Sphäroide unter dem Mikroskop. Um Bilder aufzunehmen, schalten Sie den Netzschalter ein.
Stellen Sie die 90-Millimeter-Kulturschale auf die Bühne und wählen Sie die 10-fache Vergrößerung. Passen Sie die Linsen an und untersuchen Sie die Zellen, um die Zellaggregation und -proliferation zu analysieren. Klicken Sie auf die Schaltflächen "Einfrieren" und "Speichern", um das Bild aufzunehmen.
Ersetzen Sie nach der Bildgebung das Wachstumsmedium, indem Sie vorsichtig 20 Mikroliter Medium aus jedem Tröpfchen mit einem frischen Medium absaugen. Für die Live-Dead-Bildgebung schalten Sie Strg Advanced ein, also schalten Sie eins, dann die CPU und warten Sie, bis das Softwaresystem gestartet ist. Legen Sie die 90-Millimeter-Schale mit den Sphäroiden auf die Bühne des inversen Fluoreszenzmikroskops.
Beobachten und erfassen Sie dann Bilder mit 10-facher Vergrößerung, indem Sie die Fluoreszenzoption in der Software auswählen und den FITC für den Calcein- und Texas Red-Kanal auswählen. Wählen Sie als Nächstes die Option aus, leben Sie und sehen Sie sich das Bild an. Passen Sie die Fluoreszenzintensität für eine entsprechende Optimierung an und klicken Sie auf die Schaltfläche "Sicher".
Sammeln Sie 200 Tumore, jeweils Sphäroide am siebten und 10. Tag mit einer Ein-Milliliter-Pipette und einem 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend werden die Sphäroide durch Zentrifugation bei 125 x g fünf Minuten lang pelletiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt. Waschen Sie die Sphäroide mit 200 Mikrolitern PBS, zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie 400 Mikroliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für den Sphäroidzerfall hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie kräftiges Pipettieren durch, um die Sphäroide vollständig zu zerfallen. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie einen Milliliter des vollständigen DMEM-Wachstumsmediums hinzufügen.
Dann wird die Sphäroidsuspension zentrifugiert und der Überstand verworfen, bevor das Pellet in einem Milliliter des vollständigen DMEM-Mediums resuspendiert wird. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen wie gezeigt. Für die Isolierung von Krebs-assoziierten Fibroblasten oder CAFs aus den Tumor-Sphäroiden resuspendieren Sie 1 x 10 bis zu den siebten Zellen in 80 Mikrolitern kalter magnetisch aktivierter Zellsortierung oder MACS-Puffer.
Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-Fibroblasten-Mikrokügelchen in die Zellsuspension hinzu, mischen Sie gut, indem Sie vorsichtig auf das Röhrchen klopfen und es bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter kaltem MACS-Puffer. Anschließend wird der Überstand zentrifugiert und abgesaugt, bevor das Pellet in 500 Mikroliter MACS-Puffer resuspendiert wird.
Für die magnetische Zelltrennung auf Basis von Kügelchen bereiten Sie die MACS-Säule vor, indem Sie sie mit drei Millilitern MACS-Puffer spülen. Legen Sie die Zellsuspension in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss mit der unmarkierten Zellpopulation. Als nächstes waschen Sie die Säule dreimal mit drei Milliliter MACS-Puffer, bevor Sie sie aus dem Separator nehmen.
Legen Sie dann die Säule auf das Auffangröhrchen. Sammeln Sie die mit Anti-Fibroblasten-Mikroperlen markierten Zellen, indem Sie fünf Milliliter MACS-Puffer hinzufügen und den Kolben fest in die Säule drücken. Zentrifugieren Sie die markierten Zellen, bevor Sie mit den nachgeschalteten Anwendungen fortfahren.
Zählen Sie die Anzahl der isolierten CAFs und verwenden Sie ca. 6 x 10 bis zur vierten Zelle für die Durchflusszytometrie-Analyse. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, zentrifugieren und saugen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Zellpermeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten mit intermittierendem Wirbeln, um eine Einzelzellsuspension aufrechtzuerhalten.
Nach dem Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen im Permeabilisierungspuffer werden zwei Mikroliter APC-konjugierter Anti-Human-Alpha-SMA-Antikörper hinzugefügt und 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation fügen Sie einen Milliliter Permeabilisierungspuffer hinzu und zentrifugieren, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikroliter Permeabilisierungspuffer für die Durchflusszytometrie.
Wählen Sie ACTA2-positive Zellen aus, nachdem Sie die Zellpopulationen anhand ihrer Vorwärts- und Seitenstreuung unterschieden haben. Auswahl der Singulett-Population, gefolgt von der Auswahl der ACTA2-positiven Zellen, die als einzelner Peak auf dem Einzelparameter-Histogramm erscheinen. Die Entwicklung von mehrzelligen Tumorsphäroiden und die Lebendtotanalyse werden hier gezeigt.
Am siebten Tag waren die Sphäroide kompakt und starr mit einem Durchmesser von etwa 260 Mikrometern. Am Tag 10 hatten die Sphäroide einen Durchmesser von 480 Mikrometern. Im Zelllebensfähigkeitstest wurde eine Abnahme der Propidiumiodid-Fluoreszenz und eine Zunahme der Calcein-AM-Fluoreszenz vom siebten bis zum 10. Tag beobachtet.
Die hypoxische Färbung ergab einen hypoxischen Kern im Zentrum der Tag 10 Sphäroide. Darüber hinaus wurde eine Hochregulierung der E-Cadherin- und Mki-67-Genexpression mit der Zunahme der Tage der Tumor-Sphäroidbildung beobachtet. CAFs, die ab Tag 10 isoliert wurden, waren zu etwa 69 % ACTA2-positiv.
Die CAFs zeigten im Vergleich zu den MRC-5-Fibroblasten eine dreifache Hochregulierung in ACTA2 und eine zehnfache Hochregulierung in der Kollagen-Typ-1-alpha-2-Kette. Ein signifikanter Anstieg der ROS-Spiegel an Tag 10 der Tumor-Sphäroide wurde im Vergleich zum siebten Tag beobachtet, was auf eine mögliche Beteiligung der ROS-Generierung an der CAF-Aktivierung hindeutet. Es wurde ein signifikanter Anstieg der zellulären ROS-Spiegel in CAFs beobachtet, die ab Tag sieben und Tag 10 Tumor-Sphäroide isoliert wurden.
Darüber hinaus wurde eine Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials durch JC-1-Färbung beobachtet. Eine Induktion der GLUT1- und MCT4-Genexpression wurde in CAFs im Vergleich zu normalen Fibroblasten beobachtet. Eine signifikante Induktion der Enzymaktivität von Laktatdehydrogenase, Cytochrom-C-Oxidase und Succinatdehydrogenase wurde in CAFs im Vergleich zu normalen Fibroblasten beobachtet.
Ein Verhältnis von 5:4:1 von A549-, MRC-5- und THP-1-Zellen muss für die erfolgreiche Entwicklung eines mehrzelligen 3D-Tumorsphäroids verwendet werden. Die Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Steifigkeit der Tumorsphäroide. Ähnlich wie bei der Kationenlösung und Charakterisierung kann man auch dieses Tumor-Sphäroid verwenden, um eine tumorassoziierte Makrophagen-Zellpopulation zu erhalten, die ein Komplize bei der Tumorprogression ist.
Diese Sphäroidanalyse würde uns helfen zu verstehen, wie Krebszellen gekreuzte Fibroblasten an der CAF-Aktivierung beteiligt sind, und kann auch verwendet werden, um die mitochondrialen spezifischen Medikamentenkandidaten zu überprüfen.
