Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação dos fibroblastos associados ao câncer ou CAF. Poderia ser um excelente modelo in vitro para estudar características fenotípicas. As principais restrições na biologia do CAF reside na disponibilidade limitada de CAF a partir de amostras de biópsia de tumor primário.
Portanto, essa técnica pode ser usada para estudar vários aspectos da biologia do CAF. Este estudo descreve a produção cruzada aberrante e a disfunção mitocondrial associada à ativação da CAF, levando a um prognóstico tumoral desfavorável. A aplicação deste método seria útil para avaliar as interações traumáticas do tumor, particularmente a ativação do CAF e a saúde mitocondrial.
A fim de explorar os novos alvos de drogas. Os indivíduos devem ter experiência em procedimento celular antes de realizar esta técnica. A demonstração visual desta técnica permitirá compreender as etapas críticas no isolamento da população CAF dos esferoides tumorais e aplicações a jusante para estudar a biologia CAF.
A senhorita Leena Arora, a senhorita Moyna Kalia e a Sra. Soumyajit Roy, assistentes do meu laboratório, realizam os experimentos. Para começar a crescer adenocarcinoma de pulmão humano A549 e fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 células aderentes em DMEM e monócitos humanos células THP-1 em meio de crescimento completo RPMI em frascos T25 a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada com dióxido de carbono a 5%.
Após três dias, com 80 a 85% de confluência celular, lave as células A549 e MRC-5 com um mililitro de PBS por um minuto. Em seguida, colha as células incubando-as com 500 microlitros de solução de EDTA a 0,25% de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione imediatamente quatro mililitros de meio de crescimento completo para inativar a tripsina.
Recolha a suspensão celular num tubo de 15 mililitros e solte-a a 125 x g durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um meio de crescimento completo de cinco mililitros. Para estabelecer esferoides tumorais multicelulares, conte os números de células A549, MRC-5 e THP-1 usando um contador de células para um volume de mililitro.
Após a contagem, prepare a suspensão celular na proporção de 5:4:1 e compense o volume para um mililitro com DMEM completo. Em seguida, coloque uma gota de 25 microlitros de mistura de suspensão celular na tampa de um prato de cultura de 90 milímetros. Encha o fundo do prato com 10 mililitros de água estéril.
Inverta cuidadosamente a tampa sobre a câmara de hidratação cheia de água e coloque o prato em uma incubadora de cultura de células por três dias. No quarto dia, monitore os esferoides sob o microscópio. Para adquirir imagens, ligue o interruptor de alimentação.
Coloque o prato de cultura de 90 milímetros no palco e selecione a ampliação de 10 x. Ajuste as lentes e examine as células para analisar a agregação e proliferação celular. Pressione os botões de congelamento e salvamento fornecidos para capturar a imagem.
Após a imagem, substitua o meio de crescimento aspirando cuidadosamente 20 microlitros de meio de cada gota por um meio fresco. Para imagens de mortos-vivos, ative o Ctr avançado, que é o switch um, depois a CPU e aguarde a inicialização do sistema de software. Quando inicializado, coloque o prato de 90 milímetros contendo esferoides no palco do microscópio fluorescente invertido.
Em seguida, observe e capture imagens com ampliação de 10 x selecionando a opção de fluorescência no software e selecionando o FITC para o canal calceína e Texas Red. Em seguida, selecione a opção, viva e visualize a imagem. Ajuste a intensidade de fluorescência para otimização apropriada e clique no botão seguro.
Colete 200 tumores, esferoides cada um no sétimo e 10º dia usando uma pipeta de um mililitro e um tubo de 15 mililitros. Em seguida, elimine os esferoides por centrifugação a 125 x g por cinco minutos e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave os esferoides com 200 microlitros de PBS, centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.
Adicionar 400 microlitros de solução de EDTA de tripsina a 0,25% para desintegração esferoide e incubar a 37 graus Celsius durante 10 minutos. Realize pipetagem vigorosa para a completa desintegração dos esferoides. Neutralize a tripsina adicionando um mililitro de meio de crescimento DMEM completo.
Em seguida, centrifugar a suspensão esferoide e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em um mililitro de meio DMEM completo. Conte o número total de células conforme demonstrado. Para o isolamento de fibroblastos associados ao câncer ou CAFs dos esferoides tumorais, ressuspeite 1 x 10 para as sétimas células em 80 microlitros de classificação de células ativadas magnéticas a frio ou tampão MACS.
Adicione 20 microlitros de microesferas antifibroblásticas na suspensão celular, misture bem batendo suavemente no tubo e incubando-o à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, lave as células com um mililitro de tampão MACS frio. Em seguida, centrifugar e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 500 microlitros de tampão MACS.
Para a separação celular à base de grânulos magnéticos, prepare a coluna MACS enxaguando-a com três mililitros de tampão MACS. Coloque a suspensão celular na coluna e colete o fluxo através da contenção da população celular não rotulada. Em seguida, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão MACS antes de removê-la do separador.
Em seguida, coloque a coluna no tubo de coleta. Colete as células marcadas com microesferas antifibroblastos adicionando cinco mililitros de tampão MACS e empurrando firmemente o êmbolo para a coluna. Centrifugar as células rotuladas antes de prosseguir para aplicações a jusante.
Conte o número de CAFs isolados e use aproximadamente 6 x 10 até a quarta célula para análise de citometria de fluxo. Lave as células uma vez com PBS, depois centrifugar e aspirar o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização celular e incube as células a quatro graus Celsius por 30 minutos com vórtice intermitente para manter uma única suspensão celular.
Novamente, após centrifugação e ressuspensão das células em tampão de permeabilização, adicione dois microlitros de anticorpo AME alfa humano conjugado com APC e incube a quatro graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão de permeabilização e centrifugar para remover o excesso de anticorpo. Ressuspender o pellet em 400 microlitros de tampão de permeabilização para citometria de fluxo.
Selecione as células positivas para ACTA2 depois de distinguir as populações de células com base em sua dispersão frontal e lateral. Seleção da população singlete seguida da seleção das células positivas para ACTA2 que aparecem como um único pico no histograma de parâmetro único. O desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares e a análise de mortos vivos são mostrados aqui.
No sétimo dia, os esferoides eram compactos e rígidos, com aproximadamente 260 mícrons de diâmetro. No dia 10, os esferoides tinham 480 mícrons de diâmetro. No ensaio de viabilidade celular, observou-se uma diminuição na fluorescência do iodeto de propídio e um aumento na fluorescência calceína-AM do sétimo ao dia 10.
A coloração hipóxica revelou um núcleo hipóxico no centro do dia 10 esferoides. Além disso, observou-se regulação positiva da expressão gênica de E-caderina e Mki-67 com o aumento dos dias de formação de esferoides tumorais. Os CAFs isolados dos esferoides tumorais do dia 10 foram aproximadamente 69%ACTA2 positivos.
Os CAFs apresentaram regulação positiva tripla no ACTA2 e dez vezes na cadeia alfa 2 do colágeno tipo 1 em comparação com os fibroblastos MRC-5. Um aumento significativo nos níveis de EROs no 10º dia foi observado esferoides tumorais em comparação com o sétimo dia, sugerindo o possível envolvimento da geração de ERO na ativação do CAF. Um aumento significativo foi observado nos níveis de EROs celulares em CAFs, isolados a partir do sétimo dia e do dia 10 esferoides tumorais.
Além disso, uma alteração do potencial de membrana mitocondrial foi observada pela coloração JC-1. Uma indução da expressão gênica de GLUT1 e MCT4 foi observada em CAFs em comparação com fibroblastos normais. Indução significativa da atividade da enzima lactato desidrogenase, citocromo C oxidase e succinato desidrogenase foi observada em CAFs em comparação com fibroblastos normais.
Uma proporção de 5:4:1 de células A549, MRC-5 e THP-1 deve ser usada para o desenvolvimento bem-sucedido de esferoides tumorais multicelulares 3D. A população de fibroblastos é fundamental para a rigidez dos esferoides tumorais. Semelhante à solução catiônica e caracterização, pode-se também usar este esferoide tumoral para obter a população de células de macrófagos associados ao tumor, que é cúmplice na progressão tumoral.
Esta análise esferoide nos ajudaria a entender como as células cancerosas cruzadas fibroblastos estão envolvidos na ativação dos CAFs, e também pode ser usado para verificar os candidatos a drogas mitocondriais específicas.
