Este protocolo destaca la importancia del microambiente tumoral en la activación de los fibroblastos asociados al cáncer o CAF. Podría ser un excelente modelo in vitro para estudiar las características fenotípicas. Las principales limitaciones en la biología de CAF radican en la disponibilidad limitada de CAF a partir de muestras de biopsia de tumor primario.
Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para estudiar diversos aspectos de la biología de CAF. Este estudio muestra la producción cruzada aberrante y la disfunción mitocondrial asociada con la activación de CAF que conduce a un mal pronóstico tumoral. La aplicación de este método sería útil para evaluar las interacciones traumáticas del tumor, particularmente la activación de CAF y la salud mitocondrial.
Con el fin de explorar los nuevos objetivos farmacológicos. Las personas deben tener experiencia en el procedimiento celular antes de realizar esta técnica. La demostración visual de esta técnica permitirá comprender los pasos críticos para aislar a la población de CAF de los esferoides tumorales y las aplicaciones posteriores para estudiar la biología de CAF.
La señorita Leena Arora, la señorita Moyna Kalia y la señora Soumyajit Roy, asistentes de mi laboratorio, realizan los experimentos. Para comenzar a crecer adenocarcinoma de pulmón humano A549 y fibroblastos de pulmón humano MRC-5 adherentes a células en DMEM y monocitos humanos células THP-1 en RPMI medio de crecimiento completo en matraces T25 a 37 grados centígrados en una cámara humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Después de tres días, al 80 a 85% de confluencia celular, lave las células A549 y MRC-5 con un mililitro de PBS durante un minuto. A continuación, cosechar las células incubándolas con 500 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25% durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego, agregue inmediatamente cuatro mililitros de medio de crecimiento completo para inactivar la tripsina.
Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y gránela a 125 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un medio de crecimiento completo de cinco mililitros. Para establecer los esferoides tumorales multicelulares, cuente los números de células A549, MRC-5 y THP-1 utilizando un contador de células para un mililitro de volumen.
Después de contar, prepare la suspensión celular en una proporción de 5: 4: 1 y recupere el volumen a un mililitro con DMEM completo. A continuación, coloque una gota de 25 microlitros de mezcla de suspensión celular en la cubierta de una placa de cultivo de 90 milímetros. Llene el fondo del plato con 10 mililitros de agua estéril.
Invierta cuidadosamente la tapa sobre la cámara de hidratación llena de agua y coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante tres días. En el cuarto día, monitoree los esferoides bajo el microscopio. Para adquirir imágenes, encienda el interruptor de encendido.
Coloque el plato de cultivo de 90 milímetros en el escenario y seleccione el aumento de 10x. Ajuste las lentes y examine las células para analizar la agregación y proliferación celular. Pulse los botones congelar y guardar que se proporcionan para capturar la imagen.
Después de la obtención de imágenes, reemplace el medio de crecimiento aspirando cuidadosamente 20 microlitros de medio de cada gota con un medio fresco. Para imágenes de muertos vivos, encienda Ctr avanzado, que es el interruptor uno, luego la CPU y espere a que se inicie el sistema de software. Cuando arranque, coloque el plato de 90 milímetros que contiene esferoides en la etapa del microscopio fluorescente invertido.
Luego observe y capture imágenes con un aumento de 10x seleccionando la opción de fluorescencia en el software y seleccionando el FITC para el canal de calceína y Texas Red. A continuación, seleccione la opción, en vivo y vea la imagen. Ajuste la intensidad de fluorescencia para una optimización adecuada y haga clic en el botón seguro.
Recolectar 200 tumores, esferoides cada uno en el día siete y 10 usando una pipeta de un mililitro y un tubo de 15 mililitros. Luego granular los esferoides por centrifugación a 125 x g durante cinco minutos y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Lave los esferoides con 200 microlitros de PBS, centrifugar nuevamente y deseche el sobrenadante.
Agregue 400 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25% para la desintegración de esferoides e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Realizar un pipeteo vigoroso para la desintegración completa de los esferoides. Neutralice la tripsina agregando un mililitro de medio de crecimiento DMEM completo.
Luego centrifugar la suspensión esferoide y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en un mililitro de medio DMEM completo. Cuente el número total de celdas como se demuestra. Para el aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer o CAF de los esferoides tumorales, resuspender 1 x 10 a las séptimos células en 80 microlitros de clasificación de células activadas magnéticas frías o tampón MACS.
Agregue 20 microlitros de microperlas antifibroblastos en la suspensión celular, mezcle bien golpeando suavemente el tubo e incubándolo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón MACS frío. Luego centrifugar y aspirar el sobrenadante antes de resuspender el pellet en 500 microlitros de tampón MACS.
Para la separación celular basada en perlas magnéticas, prepare la columna MACS enjuagándola con tres mililitros de tampón MACS. Coloque la suspensión celular en la columna y recoja el flujo a través de la población celular no etiquetada. A continuación, lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón MACS antes de retirarla del separador.
Luego coloque la columna en el tubo de recolección. Recoja las células marcadas con microperlas antifibroblastos agregando cinco mililitros de tampón MACS y empujando firmemente el émbolo hacia la columna. Centrifugar las celdas marcadas antes de proceder a aplicaciones posteriores.
Cuente el número de CAF aislados y use aproximadamente 6 x 10 a la cuarta célula para el análisis de citometría de flujo. Lave las células una vez con PBS, luego centrifugar y aspirar el sobrenadante. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización celular e incube las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos con vórtice intermitente para mantener una suspensión de una sola célula.
Nuevamente, después de la centrifugación y la resuspensión de las células en tampón de permeabilización, agregue dos microlitros de anticuerpo anti-SMA antihumano conjugado APC e incube a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón de permeabilización y centrifugar para eliminar el exceso de anticuerpos. Resuspender el pellet en 400 microlitros de tampón de permeabilización para citometría de flujo.
Seleccione las células positivas para ACTA2 después de distinguir las poblaciones de células en función de su dispersión hacia adelante y hacia los lados. Selección de la población de singletes seguida de la selección de las células positivas ACTA2 que aparecen como un pico único en el histograma de parámetro único. El desarrollo de esferoides tumorales multicelulares y el análisis de muertos vivos se muestran aquí.
En el séptimo día, los esferoides eran compactos y rígidos con aproximadamente 260 micras de diámetro. El día 10, los esferoides tenían 480 micras de diámetro. En el ensayo de viabilidad celular, se observó una disminución en la fluorescencia del yoduro de propidio y un aumento en la fluorescencia de calceína-AM desde el día siete hasta el día 10.
La tinción hipóxica reveló un núcleo hipóxico en el centro de los esferoides del día 10. Además, se observó una regulación positiva de la expresión génica de E-cadherina y Mki-67 con el aumento de días de formación de esferoides tumorales. Los CAF aislados de los esferoides tumorales del día 10 fueron aproximadamente 69% ACTA2 positivos.
Los CAF mostraron una regulación positiva triple en ACTA2 y diez veces en la cadena alfa 2 de colágeno tipo 1 en comparación con los fibroblastos MRC-5. Se observó un aumento significativo en los niveles de ROS en los esferoides tumorales del día 10 en comparación con el día siete, lo que sugiere la posible participación de la generación de ROS en la activación de CAF. Se observó un aumento significativo en los niveles celulares de ROS en CAFs, aislados a partir del día siete y del día 10 de los esferoides tumorales.
Además, se observó una alteración del potencial de la membrana mitocondrial mediante tinción JC-1. Se observó una inducción de la expresión génica de GLUT1 y MCT4 en CAFs en comparación con fibroblastos normales. Se observó una inducción significativa de la actividad de la lactato deshidrogenasa, la citocromo C oxidasa y la succinato deshidrogenasa en los CAF en comparación con los fibroblastos normales.
Se debe usar una proporción de 5: 4: 1 de células A549, MRC-5 y THP-1 para el desarrollo exitoso del esferoide tumoral multicelular 3D. La población de fibroblastos es crítica para la rigidez de los esferoides tumorales. Similar a la solución y caracterización de cationes, también se puede usar este esferoide tumoral para obtener población de células de macrófagos asociada al tumor, que es cómplice en la progresión tumoral.
Este análisis de esferoides nos ayudaría a comprender cómo las células cancerosas que cruzan fibroblastos están involucradas en la activación de CAFs, y también se puede utilizar para comprobar los candidatos a fármacos específicos mitocondriales.
