Ce protocole souligne l’importance du microenvironnement tumoral dans l’activation des fibroblastes associés au cancer ou CAF. Il pourrait être excellent modèle in vitro pour étudier les caractéristiques phénotypiques. Les principales contraintes en biologie de la CAF résident dans la disponibilité limitée de la CAF à partir des échantillons de biopsie tumorale primaire.
Cette technique peut donc être utilisée pour étudier divers aspects de la biologie des FAC. Cette étude décrit une production croisée aberrante et un dysfonctionnement mitochondrial associés à l’activation de la CAF conduisant à un mauvais pronostic tumoral. L’application de cette méthode serait utile pour évaluer les interactions traumatiques de la tumeur, en particulier l’activation du CAF et la santé mitochondriale.
Afin d’explorer les nouvelles cibles médicamenteuses. Les individus doivent avoir de l’expérience dans la procédure cellulaire avant d’effectuer cette technique. La démonstration visuelle de cette technique permettra de comprendre les étapes critiques pour isoler la population CAF des sphéroïdes tumoraux et les applications en aval pour étudier la biologie des CAF.
Mlle Leena Arora, Mlle Moyna Kalia et Mme Soumyajit Roy, assistantes de mon laboratoire effectuent les expériences. Pour commencer à cultiver des cellules adhérentes à l’adénocarcinome pulmonaire humain A549 et au fibroblaste pulmonaire humain MRC-5 dans le DMEM et des monocytes humains THP-1 dans le milieu de croissance RPMI complètent le milieu de croissance dans des flacons T25 à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone.
Après trois jours, à 80 à 85% de confluence cellulaire, lavez les cellules A549 et MRC-5 avec un millilitre de PBS pendant une minute. Ensuite, récoltez les cellules en les incubant avec 500 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez immédiatement quatre millilitres de milieu de croissance complet pour inactiver la trypsine.
Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et l’enduire à 125 x g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance complet de cinq millilitres. Pour établir des sphéroïdes tumoraux multicellulaires, comptez les nombres cellulaires A549, MRC-5 et THP-1 à l’aide d’un compteur de cellules pour un volume d’un millilitre.
Après le comptage, préparez la suspension cellulaire dans un rapport de 5:4:1 et portez le volume à un millilitre avec du DMEM complet. Ensuite, placez une goutte de 25 microlitres de mélange de suspension cellulaire sur le couvercle d’une boîte de culture de 90 millimètres. Remplissez le fond du plat avec 10 millilitres d’eau stérile.
Retournez soigneusement le couvercle sur la chambre d’hydratation remplie d’eau et placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Le quatrième jour, surveillez les sphéroïdes au microscope. Pour acquérir des images, allumez l’interrupteur d’alimentation.
Placez le plat de culture de 90 millimètres sur la scène et sélectionnez le grossissement de 10 x. Ajustez les lentilles et examinez les cellules pour analyser l’agrégation et la prolifération cellulaires. Appuyez sur les boutons d’arrêt sur commande et d’enregistrement fournis pour capturer l’image.
Après l’imagerie, remplacez le milieu de croissance en aspirant soigneusement 20 microlitres de milieu de chaque gouttelette avec un milieu frais. Pour l’imagerie en direct, activez Ctr avancé, qui est le commutateur un, puis le processeur et attendez que le système logiciel démarre. Lors du démarrage, placez la parabole de 90 millimètres contenant des sphéroïdes sur la scène du microscope fluorescent inversé.
Ensuite, observez et capturez des images à un grossissement de 10 x en sélectionnant l’option de fluorescence dans le logiciel et en sélectionnant le FITC pour la calcéine et le canal Texas Red. Ensuite, sélectionnez l’option, en direct et affichez l’image. Ajustez l’intensité de fluorescence pour une optimisation appropriée et cliquez sur le bouton de sécurité.
Recueillir 200 tumeurs, sphéroïdes chacun le septième jour et 10 à l’aide d’une pipette d’un millilitre et d’un tube de 15 millilitres. Pelletez ensuite les sphéroïdes par centrifugation à 125 x g pendant cinq minutes et aspirez soigneusement le surnageant. Lavez les sphéroïdes avec 200 microlitres de PBS, centrifugez à nouveau et jetez le surnageant.
Ajouter 400 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine pour la désintégration des sphéroïdes et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuer un pipetage vigoureux pour une désintégration complète des sphéroïdes. Neutraliser la trypsine en ajoutant un millilitre de milieu de croissance DMEM complet.
Ensuite, centrifuger la suspension sphéroïde et jeter le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu DMEM complet. Comptez le nombre total de cellules comme indiqué. Pour l’isolement des fibroblastes associés au cancer ou CAF des sphéroïdes tumoraux, remettre en suspension 1 x 10 à la septième cellule dans 80 microlitres de tri cellulaire activé magnétique froid ou tampon MACS.
Ajouter 20 microlitres de microbilles anti-fibroblastes dans la suspension cellulaire, bien mélanger en tapotant doucement le tube et en l’incubant à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les cellules avec un millilitre de tampon MACS froid. Puis centrifuger et aspirer le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon MACS.
Pour la séparation cellulaire à base de billes magnétiques, préparez la colonne MACS en la rinçant avec trois millilitres de tampon MACS. Placez la suspension cellulaire dans la colonne et recueillez le flux contenant la population cellulaire non marquée. Ensuite, lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon MACS avant de la retirer du séparateur.
Placez ensuite la colonne sur le tube de collecte. Recueillez les cellules marquées par microbilles anti-fibroblastes en ajoutant cinq millilitres de tampon MACS et en poussant fermement le piston dans la colonne. Centrifuger les cellules étiquetées avant de procéder à des applications en aval.
Compter le nombre de CAF isolés et utiliser environ 6 x 10 à la quatrième cellule pour l’analyse par cytométrie en flux. Lavez les cellules une fois avec du PBS, puis centrifugez et aspirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation cellulaire et incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes avec un vortex intermittent pour maintenir une suspension unicellulaire.
Encore une fois, après centrifugation et remise en suspension des cellules dans un tampon de perméabilisation, ajoutez deux microlitres d’anticorps anti-SMA alpha humain conjugué APC et incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon de perméabilisation et centrifuger pour éliminer l’excès d’anticorps. Remettez la pastille en suspension dans 400 microlitres de tampon de perméabilisation pour cytométrie en flux.
Sélectionnez les cellules positives ACTA2 après avoir distingué les populations de cellules en fonction de leur diffusion vers l’avant et sur le côté. Sélection de la population singulet suivie de la sélection des cellules positives ACTA2 qui apparaissent comme un seul pic sur l’histogramme à paramètre unique. Le développement de sphéroïdes tumoraux multicellulaires et l’analyse des morts vivants sont présentés ici.
Le septième jour, les sphéroïdes étaient compacts et rigides avec environ 260 microns de diamètre. Au jour 10, les sphéroïdes avaient un diamètre de 480 microns. Dans le test de viabilité cellulaire, une diminution de la fluorescence de l’iodure de propidium et une augmentation de la fluorescence calcéine-AM du septième au jour 10 ont été observées.
La coloration hypoxique a révélé un noyau hypoxique au centre du jour 10 sphéroïdes. En outre, une régulation positive de l’expression des gènes E-cadhérine et Mki-67 avec l’augmentation du nombre de jours de formation de sphéroïdes tumoraux a été observée. Les CAF isolés à partir de sphéroïdes tumoraux du jour 10 étaient positifs à environ 69% ACTA2.
Les CAF ont montré une régulation à la hausse trois fois dans ACTA2 et dix fois dans la chaîne alpha 2 du collagène de type 1 par rapport aux fibroblastes MRC-5. Une augmentation significative des niveaux de ROS sur les sphéroïdes tumoraux du jour 10 a été observée par rapport au septième jour, suggérant l’implication possible de la génération de ROS sur l’activation de la CAF. Une augmentation significative a été observée dans les niveaux de ROS cellulaires dans les CAF, isolés à partir de sphéroïdes tumoraux du septième jour et du jour 10.
De plus, une altération du potentiel de la membrane mitochondriale a été observée par coloration JC-1. Une induction de l’expression des gènes GLUT1 et MCT4 a été observée dans les CAF par rapport aux fibroblastes normaux. Une induction significative de l’activité enzymatique de la lactate déshydrogénase, de la cytochrome C oxydase et de la succinate déshydrogénase a été observée dans les CAF par rapport aux fibroblastes normaux.
Un rapport de 5:4:1 de cellules A549, MRC-5 et THP-1 doit être utilisé pour le développement réussi de sphéroïdes tumoraux multicellulaires 3D. La population de fibroblastes est essentielle pour la rigidité des sphéroïdes tumoraux. Semblable à la solution cationique et à la caractérisation, on peut également utiliser ce sphéroïde tumoral pour obtenir une population de cellules macrophages associées à la tumeur, qui est complice de la progression tumorale.
Cette analyse sphéroïde nous aiderait à comprendre comment les cellules cancéreuses croisées des fibroblastes sont impliquées dans l’activation des CAF, et peut également être utilisée pour vérifier les candidats médicaments mitochondriaux spécifiques.
