يتيح هذا البروتوكول التقييمات المحلية لكل من بنية الكولاجين وخصائص الفشل الميكانيكي لأنسجة البلاك الليفية. نظرا لأنه تم إجراء كل من التقييمات الهيكلية والميكانيكية على نفس عينة الأنسجة ، فإن هذه التقنية تسمح بكشف الرابط الوظيفي بين التقييمات الهيكلية والميكانيكية للأنسجة. المعرفة التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول حول بنية أنسجة البلاك الليفي وخصائص الفشل هي المفتاح لمنع والتنبؤ بالأحداث المميتة السريرية الناجمة عن تمزق اللويحات تصلب الشرايين.
للبدء ، قم بقطع البلاك مفتوحا على طول المحور الطولي للشريان باستخدام مقص جراحي وملاقط. قطع عينات الاختبار المستطيلة من عينات البلاك ، والتأكد من أن العينات كبيرة قدر الإمكان مع تجنب مناطق الأنسجة التي تحتوي على تمزقات أو تكلسات. بعد ذلك ، خذ عينة اختبار البلاك وقم بتثبيت طرفيها على السيليكون عن طريق تثبيت الإبر في الأنسجة.
أدخل الإبر في منطقة العينة التي ستكون في مشابك جهاز اختبار الشد أثناء الاختبار الميكانيكي. ارتد نظارات السلامة. استخدم قاطعا جانبيا لتقصير الإبر بحيث تبرز أقل من بضعة ملليمترات فوق سطح العينة لمنعها من إتلاف هدف المجهر.
املأ طبق بتري ببرنامج تلفزيوني حتى تغمر العينة. بعد ذلك ، قم بتشغيل نظام المجهر ، وقم بتشغيل مفتاح multiphoton ، وافتح برنامج تشغيل المجهر. ضع طبق بتري الذي يحتوي على عينة الاختبار تحت الهدف واخفض هدف المجهر.
قم بتشغيل وضع الفحص المباشر. انقل الهدف إلى زاوية من العينة باستخدام المقابض الموجودة على اللوحة الذكية وانقر رمز موضع العلامة في لوحة مسح التجانب. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فستظهر شبكة بها جميع المربعات المحددة للتصوير باللون البرتقالي.
بعد ذلك ، انقر فوق ابدأ في الزاوية اليمنى السفلية من الشاشة لإنشاء مسح تجانب لسطح العينة بالكامل للحصول على نظرة عامة على هندسة العينة. بعد فحص التجانب، لاحظ إحداثيات X و Y للزاوية العلوية اليسرى من اللوحة العلوية اليسرى في لوحة مسح التجانب المعروضة تلقائيا. لاحظ هذه الإحداثيات في جدول بيانات.
في لوحة مسح التجانب، لاحظ عدد الإطارات المتجانبة في الاتجاهين X وY في المربع المسمى ScanField. لاحظ حجم فحص التجانب في جدول البيانات. احسب إحداثيات البلاطات الأخرى عن طريق إضافة حجم البلاطة أو طرحه.
من فحص التجانب، حدد البلاطات المراد تصويرها بجيل توافقي ثان، أو تصوير SHG. للتحديد ، تجنب البلاط في المشابك واترك بلاطة واحدة بين كل بلاطة محددة في كل من الاتجاه الطولي والمحيطي. بعد ذلك، حدد موقع اللوحات المراد تصويرها باستخدام الإحداثيات المحسوبة في جدول البيانات هذا.
املأ الإحداثيات في المربعات المخصصة وانقر فوق Enter بحيث ينتقل الهدف إلى اللوحة اليمنى. قم بتشغيل وضع الفحص المباشر. قم بزيادة طاقة الليزر متعددة الفوتونات أو MP باستخدام شريط التمرير في اللوحة العلوية وإعدادات مسار الحزمة للحصول على أعلى طاقة ليزر ممكنة دون تبييض كبير.
بعد ذلك ، اضبط كسب الكاشف للحصول على صور ساطعة بدون وحدات بكسل مشبعة باستخدام المقبض الموجود على اللوحة الذكية أو بالنقر فوق اسم الكاشف وإعدادات مسار الشعاع والقنوات الإضافية. تتراوح القيم النموذجية لكسب الكاشف بين 500 و 800 فولت. استخدم مقبض Z-position على اللوحة الذكية لضبط مستوى التركيز البؤري.
بعد ذلك ، انتقل إلى أعلى العينة وقم بتعيين مواضع الجزء العلوي من Z-stack بالنقر فوق رأس السهم في لوحة Z-stack أسفل علامة التبويب Acquisition من اللوحة الثالثة. بعد ذلك ، ركز على العينة حتى لا يتم اكتشاف إشارة SHG. مرة أخرى ، انقر فوق رأس السهم في لوحة Z-stack لتعيين هذا الموضع.
عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل وضع المسح المباشر. ضمن علامة التبويب Acquisition في اللوحة الثانية ، حافظ على سرعة المسح الضوئي عند 400 هرتز ، واضبط متوسط الخط على اثنين ، والدقة على 512 × 512 بكسل لكل صورة باستخدام القوائم المنسدلة. قم بالتبديل إلى زر المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه.
انقر فوق حجم z-step في لوحة Z-stack واملأ حجم خطوة z من ثلاثة ميكرون في المربع. انقر فوق ابدأ في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة لإنشاء مكدس Z. عند الانتهاء ، احفظ إحداثيات التجانب في اسم الملف أو أعط كل بلاطة رقمها.
بعد التصوير ، تتعرض العينة للاختبار الميكانيكي. لتوليد نمط spackle ، أمسك البخاخة المملوءة بصبغة الأنسجة على بعد حوالي 30 سم من عينة الاختبار ورشها على سطح التجويف. بعد ذلك ، لاختبار الشد أحادي المحور ، ضع العينة في مشابك جهاز اختبار الشد مع محاذاة الاتجاه المحيطي للعينة مع اتجاه تمدد الشد والجانب التجويف من العينة متجها لأعلى.
تأكد من ضبط طول المقياس الأولي بحيث تكون نسبة العرض إلى الطول للشريط أقل من واحد. أحكم ربط مسامير المقابض عن طريق تطبيق عزم دوران يبلغ 20 سنتنيوتن متر باستخدام مفك عزم الدوران. أضف برنامج تلفزيوني إلى حمام التدفئة حتى تغمر العينة.
قم بتمزيق خلية الحمل وابدأ في تسجيل قياسات القوة والإزاحة العالمية من خلية الحمل ومشغل جهاز اختبار الشد. قم بتصويب العينة عن طريق تطبيق تمدد مسبق قدره 0.05 نيوتن للتخلص من الركود في العينة. قم بإجراء 10 دورات من التكييف المسبق ، حتى إجهاد 10٪ ، بناء على قياس طول المقياس بواسطة المشغل بعد تطبيق التمدد المسبق.
ابدأ اختبار الشد أحادي المحور حتى الفشل الكامل للعينة أثناء تسجيل مقطع فيديو لتشوه العينة بالكاميرا عالية السرعة. بعد الفشل ، توقف عن تسجيل قياسات القوة العالمية والإزاحة. افتح مكدسات Z التي تم الحصول عليها أثناء الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، أو MPM ، باستخدام SHG في الصورة J وقم بإنشاء إسقاطات قصوى الكثافة ، أو MIPs ، لكل مكدس Z.
قم بتحليل كل MIP باستخدام أداة تحليل اتجاه الألياف مفتوحة المصدر المستندة إلى MATLAB لقياس زاوية اتجاه ألياف الكولاجين الفردية الموجودة في البلاط. استخدم أداة أخرى تستند إلى MATLAB ، FibLab ، لتناسب توزيع Gaussian مع الرسم البياني لتوزيع الزاوية. من مخطط التوزيع الغاوسي ، استخرج المعلمات الهيكلية مثل زاوية الألياف السائدة ، وهي طريقة التوزيع ، والانحراف المعياري لتوزيع زاوية الألياف ، والكسر متباين الخواص.
قم بإجراء فحص بصري على صور الكاميرا لتحديد الإطار الذي يحدث فيه بدء التمزق. تحديد بصريا موقع التمزق. قم بإجراء تحليل ارتباط الصورة الرقمية ، DIC ، باستخدام برنامج ncorr المستند إلى MATLAB باستخدام صور الكاميرا المسجلة أثناء اختبار الشد.
حدد الإطار الأخير قبل التمدد النهائي حتى الفشل كصورة مرجعية. بالنسبة للصور الحالية، حدد ll للصور من بداية التمدد النهائي حتى الإطار الأخير قبل الإطار الذي حدث فيه بدء التمزق. حدد سطح العينة كمنطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار.
استبعاد المناطق القريبة من المشابك. قم بإجراء DIC عن طريق تعيين نصف قطر المجموعة الفرعية للمعلمة إلى 30 بكسل ، وتباعد المجموعة الفرعية إلى ثلاثة بكسل ، وقطع التكرار إلى 50 ، ومعيار قطع متجه الفرق إلى 10 إلى قوة خمسة ، ونصف قطر الإجهاد إلى خمسة ، وخطوة الانتشار الذاتي إلى خمسة. من تحليل DIC مع ncorr ، احصل على توزيعات سلالة Green-LaGrange أو Eulerian لعائد الاستثمار.
استخدم توزيعات الإجهاد هذه لحساب متوسط سلالة Green-LaGrange لسطح عينة اللوحة بالكامل في الإطار الأخير قبل التمزق. احسب سلالة جرين لاجرانج في موقع التمزق. باستخدام المعالم الطبيعية في عينة الاختبار ، قم بعمل تراكب للصورة المرجعية ومسح البلاط لتحديد موقع التمزق في مسح البلاط.
حدد بلاط MPM-SHG حيث حدث التمزق. إذا لم يكن التمزق في بلاطة تم مسحها ضوئيا باستخدام MPM-SHG ، فحدد البلاط الأقرب إلى موقع التمزق. الحصول على المعلمات الهيكلية الموجودة في البلاط حيث حدث التمزق.
تظهر هنا عينة جديدة وسليمة من البلاك مع القليل من التمزقات والتكلسات الكبيرة أو بدونها. يمكن استرداد عينات البلاك من المناطق التي لا تحتوي على هذه التمزقات والتكلسات. يوفر تصوير SHG والمعالجة اللاحقة للصور MIPs من كل بلاطة مصورة.
مزيد من المعالجة اللاحقة عن طريق الكشف عن الألياف ينتج عنه الرسوم البيانية اتجاه الألياف التي يمكن استخراج المعلمات الهيكلية للكولاجين منها. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحصول على خرائط ملونة توضح معلمات الكولاجين الهيكلية المحلية عبر عينة البلاك بأكملها للتحليل البصري. من عينات الاختبار هذه ، لوحظ تباين كبير داخل العينة في معلمات الكولاجين الهيكلية.
يتم توضيح بدء التمزق وانتشاره في عينة أنسجة البلاك أثناء اختبار الشد هنا. يوفر تحليل ارتباط الصور الرقمية خرائط تشوه الأنسجة المحلية ، مثل خرائط سلالة Green-LaGrange. من خرائط الإجهاد هذه ، لوحظ تباين كبير داخل العينة في السلالات المحلية.
بمجرد تحديد موقع التمزق في تسجيلات الكاميرا ، يمكن تعيينه مرة أخرى إلى صورة الكاميرا المرجعية ومسح بلاط الفحص المجهري. يوفر هذا بلاط MPM-SHG حيث حدث التمزق والمعلمات الهيكلية الموجودة في هذا البلاط. قد يكون الحصول على عينات الأنسجة الليفية الخالية من التكلسات وذات الحجم الكبير بما يكفي للاختبار الميكانيكي مهمة صعبة للويحات المتكلسة بشدة.
بمجرد تحديد ميزة ميكانيكية أو هيكلية كمؤشر لفشل أنسجة البلاك الليفي ، سيسمح نظام التصوير في الجسم الحي الذي يقيس هذه الميزة بالتنبؤ بمخاطر تمزق البلاك لدى المرضى.
