Wir danken Dr. Evan Jellison und Frau Li Zhu im Durchflusszytometrie-Kern von UConn Health für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie, Dr. Lynn Puddington in der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Unterstützung der Instrumente, Frau Slawa Gajewska und Dr. Paul Appleton im klinischen Forschungskern von UConn Health für ihre Hilfe bei der Gewinnung von Blutproben. Wir danken Dr. Christopher "Kit" Bonin und Dr. Geneva Hargis von der UConn School of Medicine für ihre Hilfe beim wissenschaftlichen Schreiben und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), des National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, eines Career Development Award der American Heart Association (18CDA34110426) und eines Startkapitalfonds von UConn Health unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Heparinisierte Vollblutproben wurden von anonymisierten gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen, wie vom Institutional Review Board der UConn Health genehmigt. Von allen Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Ein-/Ausschlusskriterien für diese Studie wurden sorgfältig entwickelt, um die Eignung der Teilnehmer sicherzustellen und potenzielle Risiken zu minimieren. Die teilnahmeberechtigten Teilnehmer waren zwischen 18 und 65 Jahre alt, hatten eine beliebige ethnische Zugehörigkeit, sprachen fließend Englisch und waren in der Lage, eine informierte Einwilligung zu geben. Zu den ausgeschlossenen Teilnehmern gehörten diejenigen, die nicht in der Lage waren, eine Einwilligung nach Aufklärung für sich selbst zu geben, wie z. B. diejenigen, die einen gesetzlichen Vertreter benötigen, Personen unter 18 oder über 65 Jahren, inhaftierte Personen und schwangere Frauen. Darüber hinaus mussten die Teilnehmer frei von entzündungshemmenden Medikamenten und entzündlichen Zuständen sein. Aktuelle Infektionen oder anhaltende chronische oder akute Entzündungszustände waren ebenfalls Ausschlusskriterien. Schließlich waren Personen mit einer aktuellen oder kürzlichen COVID-19-Infektion in der Vorgeschichte nicht für die Studie geeignet. Diese Kriterien wurden entwickelt, um die Sicherheit und Eignung der Teilnehmer zu gewährleisten und gleichzeitig potenzielle Störfaktoren zu minimieren, die sich auf die Studienergebnisse auswirken könnten.
1. Herstellung der Reagenzien
<ol><li>Neutrophiles Medium: Bereiten Sie das neutrophile Medium vor, indem Sie RPMI-1640 2 % humanes Serumalbumin ohne Phenolrot hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>fMLP-Lösung: Bereiten Sie die fMLP-Lösung vor, indem Sie sie 100-fach aus der 10-mM fMLP-Speicherlösung für Dimethylsulfoxid (DMSO) (siehe Materialtabelle) mit RPMI 1640 ohne Phenolrot verdünnen, was zu einer 100 μM fMLP-Lösung führt.</li>
	<li>Antikörperlösung: Verdünnen Sie 120 μl des mit Allophycocyanin (APC) konjugierten monoklonalen Antikörpers mAb24 (mAb24-APC) (siehe Materialtabelle), der die hochaffine Konformation von β2-Integrin angibt, in 10 ml neutrophilem Medium, wodurch eine 1,2 μg/ml mAb24-APC-Lösung entsteht.</li>
	<li>Compound-Bibliothek: Verdünnen Sie die anfängliche Compound-Bibliothek mit einer Konzentration von 10 mM bis 1 mM, indem Sie 5 μl der 10-mM-Bibliothek (siehe Materialtabelle) zu 45 μl DMSO in 384-Well-Platten mit dem Liquid Handler hinzufügen. Anschließend werden 5 μl pro Well der 1-mM-Compound-Bibliothek mit dem Liquid Handler auf eine leere 384-Well-Platte übertragen.</li>
	<li>Wie in Abbildung 1 dargestellt, enthielten vier Spalten ( 1, 2, 23, 24) nur DMSO, aber keine Verbindungen, die als Positiv- und Negativkontrollen im Screening dienten. Jede Vertiefung wird weiter verdünnt, indem 45 μl RPMI-1640 ohne Phenolrot hinzugefügt werden, was zu einer Endkonzentration von 100 μM für alle Verbindungen führt.</li>
</ol>2. Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut
<ol><li>Mit einer serologischen Pipette vorsichtig 4 ml Blut über 8 ml eines handelsüblichen Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen schichten (Abbildung 2A).</li>
	<li>Das Blut wird bei 550 × g für 30-50 min bei 20 °C zentrifugiert. Bremsen Sie den Rotor schrittweise ab (Verzögerungsfaktor 1). HINWEIS: Die erfolgreiche Trennung von Neutrophilen (Band 2 in Abbildung 2B) von roten Blutkörperchen kann je nach Spender variieren. Für die meisten Spender ist eine 30-minütige Zentrifugation ausreichend. Bei einigen Spendern kann jedoch eine zusätzliche Zentrifugation von 10 bis 30 Minuten erforderlich sein, wenn die Trennung nicht erfolgreich ist (Abbildung 2C).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Plasma (die gelbe Flüssigkeit auf der Oberseite) und die mononukleären Zellen (das obere trübe Band; PBMC-Bande in Abbildung 2B) mit einer 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Neutrophile Granulozyten werden aus dem unteren trüben Band (Neutrophilenband in Abbildung 2B) und etwa 3-4 ml unterhalb der klaren Flüssigkeit in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gesammelt. Mischen Sie die Neutrophilensuspension vorsichtig, indem Sie sie 2-3 Mal invertieren.</li>
	<li>Die Suspension wird bei 400 × g für 10 min bei 20 °C zentrifugiert und anschließend der Überstand vorsichtig durch Dekantieren entfernt.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 5 ml PBS und zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 5 Minuten bei 20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie vorsichtig alle Restüberstände um die Röhrchenmündung und an der Röhrchenwand durch Vakuumabsaugung. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml neutrophilem Medium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Typischerweise wurden 1 bis 4 × 107 Neutrophile aus 8 ml menschlichem Blut gewonnen. HINWEIS: Es kann zu einer Kontamination der roten Blutkörperchen in der Neutrophilensuspension kommen. Rote Blutkörperchen haben keinen signifikanten Einfluss auf die meisten Assays und können die Aktivierung/das Priming von Neutrophilen verhindern27. Rote Blutkörperchen müssen vor der Zählung lysiert werden, um eine genaue Neutrophilenkonzentration zu erhalten. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension für 10-30 s zu 891 μl deionisiertem Wasser, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und fügen Sie dann 99 μl 10× PBS hinzu, um den osmotischen Druck auszugleichen und die Lyse der Neutrophilen zu verhindern.</li>
	<li>Stellen Sie die Zelldichte auf 6,25 × 105 Zellen/ml ein, indem Sie neutrophiles Medium hinzufügen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der 384-Well-Platte
<ol><li>In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen wird 1 ml der Antikörperlösung (1,2 μg/ml mAb24-APC) mit 0,2 ml neutrophilem Medium vermischt, um eine 1 μg/ml mAb24-APC-Lösung herzustellen. Geben Sie dann 25 μl dieser Mischung in die Negativkontrollvertiefungen in einer 384-Well-Platte (die blauen Wells in Abbildung 1).</li>
	<li>In einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen werden 9 ml der Antikörperlösung mit 21,6 μl der fMLP-Lösung (100 μM) und 1,7784 ml neutrophilem Medium gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die 1 μg/ml mAb24-APC und 200 nM fMLP enthält. Als Nächstes werden 25 μl dieser Mischung in die Positivkontroll- und Testvertiefungen in einer 384-Well-Platte gegeben (die roten und blauen Wells in Abbildung 1).</li>
	<li>Übertragen Sie 5 μl der 100-μM-Verbindungslösungen mit einer Mehrkanalpipette von der Verbindungsbibliotheksplatte auf die 384-Well-Platte.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit 1 Minute lang bei 500 × g bei Raumtemperatur. HINWEIS: Zum Zentrifugieren von Platten sind ein Ausschwingrotor und Plattenbecher erforderlich.</li>
</ol>4. Behandlung von Zellen
<ol><li>Geben Sie 20 μl der neutrophilen Suspension mit einer 16-Kanal-Pipette (5-50 μl-Bereich für jede Säule der 384-Well-Platte) in jede Vertiefung. Mischen Sie vorsichtig 5-10 Mal mit der Pipette und halten Sie dabei ein gleichbleibendes Zeitintervall zwischen den einzelnen Pipettiervorgängen ein. ANMERKUNG: Die endgültigen Konzentrationen in den Wells sind wie folgt: Neutrophile 2,5 × 105 Zellen/ml (alle Wells); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle Vertiefungen); fMLP 100 nM (Positivkontroll- und Testbohrungen); Verbindungen 10 μM (Testbrunnen).</li>
	<li>Die Platte auf einem Schüttler bei 300 U/min bei Raumtemperatur (RT) 10 Minuten lang inkubieren.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 16-Kanal-Pipette 3 μl 16 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung geben (endgültige PFA-Konzentration ~0,91 %). Dann 10 Minuten auf Eis inkubieren. HINWEIS: Es wird empfohlen, beim Hinzufügen von Neutrophilen und PFA ein konsistentes Zeitintervall zwischen den verschiedenen Spalten einzuhalten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Neutrophilen in jedem Well die gleiche Inkubationszeit mit fMLP und mAb24-APC haben.</li>
</ol>5. Durchflusszytometrie
<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass der an das Gerät angeschlossene Computer ebenfalls eingeschaltet ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Behälter für die Mantelflüssigkeit gefüllt ist und der Abfallbehälter leer und ordnungsgemäß an das Gerät angeschlossen ist.</li>
	<li>Laden Sie die 384-Well-Platte auf den Probenlader des Durchflusszytometers. Stellen Sie sicher, dass die A1-Vertiefung der Platte mit der A1-Markierung auf dem Lader übereinstimmt.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software und erstellen Sie ein neues Experiment. Wählen Sie 384 Well und wählen Sie die gewünschten Fluorophore. Klicken Sie anschließend auf Plate setup, ziehen Sie, um alle Wells auszuwählen, und klicken Sie dann auf Sample. Aktivieren Sie den Schalter "Hoher Durchsatz" und wählen Sie im Bereich "Rate" die Option "Hoch" aus.<ol><li>Geben Sie im Feld Volume den Wert 50 ein. Wählen Sie Proben in ungeraden Spalten aus und aktivieren Sie dann den Schalter "Rühren". Benennen Sie abschließend die Beispiele im rechten Bereich.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Plot and gate. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Anwenden" (zwei Pfeile auf einem grün gefüllten Kreis) und anschließend auf die Schaltfläche "Wiedergabe" (Dreiecksform). Warten Sie einige Sekunden, um einige Zellen aus der ersten Vertiefung zu beobachten, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Pause.<ol><li>Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen an, um eine korrekte Visualisierung der Zellen im Diagramm zu gewährleisten. Klicken Sie auf Akquisition und dann auf die Wiedergabeschaltfläche (Dreiecksform), um den Assay zu starten.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Durchflusszytometer entnimmt sequentiell ~50 μl von 1000-3000 Neutrophilen aus jeder Vertiefung. Es wird etwa 3 Stunden dauern, bis die gesamte 384-Well-Platte fertiggestellt ist.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Beispiele abgeschlossen haben, exportieren Sie die FCS-Dateien für den nächsten Schritt.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die Datenanalyse-Software für die Durchflusszytometrie (siehe Materialtabelle). Wählen Sie den Ordner mit allen .fcs-Dateien aus, ziehen Sie ihn in das Softwarefenster und lassen Sie ihn los, um die Daten in die Software zu importieren.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf eine Probe, um einzelne Neutrophile basierend auf FSC und SSC28,29,30 im Pop-up-Fenster zu gruppieren, wie in Abbildung 3 gezeigt. Wählen Sie die abgegrenzten Zeilen aus, ziehen Sie sie in den Ordner und lassen Sie sie dann los, um das Gating auf alle Beispiele in diesem Ordner anzuwenden.</li>
	<li>Berechnen und exportieren Sie die mittlere APC-Fluoreszenzintensität (MFI) von Neutrophilen aus jedem Well mit der Tabelleneditor-Funktion der Software. Klicken Sie auf Spalte hinzufügen auf der Registerkarte Bearbeiten. Wählen Sie auf der Registerkarte Statistik die Option Median aus, wählen Sie die Neutrophilen der eingeschränkten Population aus, und wählen Sie APC als Parameter aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK.</li>
	<li>Kehren Sie zur Registerkarte "Tabelleneditor" zurück, wählen Sie auf der Registerkarte "Gruppe" die Option Alle Beispiele aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Tabelle erstellen . Es erscheint ein neues Fenster, in dem die erstellte Tabelle angezeigt wird. Speichern Sie es als Text-, CSV- oder Excel-Datei.</li>
	<li>Öffnen Sie die exportierte Tabelle, berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung des APC-MFI für die positiven und negativen Kontrollproben (Abbildung 4).</li>
	<li>Berechnen Sie den Z'-Faktor (Z') der Platte mit der Gleichung: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), wobei σ p und σ n die Standardabweichungen der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind und μp und μn die Mittelwerte der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind31. ANMERKUNG: Der Faktor Z' gibt die Trennung der positiven und negativen Kontrollverteilung an. Ein Z' von 0 bedeutet keine Trennung, während ein Z' von 0,5 eine gleichmäßige Trennung angibt. Wie bereits in einer früheren Studieerwähnt 31, weist Z' > 0,5 auf einen ausgezeichneten Assay für das Screening von Verbindungen hin. Ein Z' im Bereich von 0,5 bis 0 ist akzeptabel, aber es kann nur starke Treffer im Assay identifizieren, was eine weitere Validierung in sekundären Assays erfordert.</li>
	<li>Betrachten Sie Verbindungen als "Treffer" für das Screening, wenn der APC-MFI von mit Substanzen behandelten Neutrophilen niedriger ist als das Dreifache der Standardabweichung des MFI der Positivkontrolle, subtrahiert vom MFI der Positivkontrolle (P = 0,0013, dargestellt durch die gestrichelte Linie in Abbildung 4).</li>
</ol>

Screening von β2-Integrin-Aktivierungsinhibitoren in humanen Neutrophilen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Initiierung und Beendigung der Stimulation und Färbung von Neutrophilen wird durch die Zugabe von Neutrophilen und dem Fixiermittel PFA bestimmt. Daher ist es wichtig, das gleiche Zeitintervall zwischen dem Pipettieren von Neutrophilen oder PFA in jede Säule zu gewährleisten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Stimulations- und Färbezeit der Neutrophilen aus jeder Vertiefung konstant bleibt. Aufgrund der kurzen Lebensdauer von Neutrophilen muss das gesamte Experiment, von der Blutentnahme bei den Spendern bis ...

Viele entzündliche Erkrankungen sind durch die Infiltration von Neutrophilen an der Schwellungs- oder Verletzungsstelle gekennzeichnet1. Um in diese Gewebe einzudringen, müssen die Neutrophilen die Rekrutierungskaskade der Neutrophilen durchlaufen, die einen Arrest im Endothel, eine Extravasation über die Gefäßwand und eine Rekrutierung in das Gewebe beinhaltet2. Zirkulierende Neutrophile benötigen eine β2-Integrin-Aktivierung, um diese Kaskade zu vervollständigen, insbesondere für die Arrestphase. Daher können Integrin-hemmende Medikamente, die die Adhäsion, Extravasation und Rekrutierung von Neutrophilen reduzieren, entzündliche Erkrankungen wirksam behandeln 3,4.
β2-Integrine wurden schon früher für entzündliche Erkrankungen ins Visier genommen. Efalizumab, ein monoklonaler Antikörper, der direkt gegen Integrin αLβ2 gerichtet ist, wurde zur Behandlung von Psoriasis5 entwickelt. Efalizumab wurde jedoch aufgrund seiner tödlichen Nebenwirkung - progressiver multifokaler Leukenzephalopathie infolge einer Reaktivierung des JC-Virus - zurückgezogen 6,7. Neue entzündungshemmende Integrin-basierte Therapien sollten die Aufrechterhaltung der antiinfektiösen Funktionen von Leukozyten berücksichtigen, um Nebenwirkungen zu minimieren. Die Nebenwirkungen von Efalizumab könnten auf die verlängerte Zirkulation monoklonaler Antikörper im Blutkreislauf zurückzuführen sein, die langfristig die Immunfunktionen hemmen könnten8. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Efalizumab die αLβ2-Vernetzung und die unerwünschte Internalisierung von α4-Integrinen vermittelt, was eine alternative Erklärung für die Nebenwirkungen liefert9. Daher könnten kurzlebige, niedermolekulare Antagonisten dieses Problem vermeiden.
Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening von niedermolekularen β2-Integrin-Antagonisten unter Verwendung humaner Neutrophiler wird hier vorgestellt. Die β2-Integrinaktivierung erfordert Konformationsänderungen der Integrin-Ektodomäne, um Zugang zu ihrem Liganden zu erhalten und ihre Bindungsaffinität zu diesem zu erhöhen. Im kanonischen Switchblade-Modell dehnt sich die gebogene geschlossene Integrin-Ektodomäne zunächst zu einer extended-closed Konformation aus und öffnet dann ihr Kopfstück zu einer vollständig aktivierten extended-open Konformation10,11,12,13. Es gibt auch einen alternativen Weg, der vom gebogen-geschlossenen zum gebogen-offenen und ausgestreckt-offenen Weg führt, schließlich 14,15,16,17,18,19. Der konformationsspezifische Antikörper mAb24 bindet an ein Epitop in der humanen β2-I-ähnlichen Domäne, wenn das Kopfstück der Ektodomäne geöffnet ist20,21,22,23.
Hier wird mit mAb24-APC bestimmt, ob die β2-Integrine aktiviert sind. Zur Aktivierung von Neutrophilen und Integrinen wird in diesem Protokoll N-Formylmethionyl-Leucylphenylalanin (fMLP), ein aus Bakterien gewonnenes kurzes chemotaktisches Peptid, das neutrophile β2-Integrine24 aktivieren kann, als Stimulus verwendet. Wenn fMLP an das Fpr1 auf Neutrophilen bindet, werden nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, an denen G-Proteine, Phospholipase Cβ und Phosphoinositid-3-Kinase-γ beteiligt sind. Diese Signalereignisse führen letztendlich zu einer Integrinaktivierung über den Inside-Out-Signalweg18,25. Neben niedermolekularen Antagonisten, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen der Integrinaktivierungverhindern 26, würden mit dieser Methode auch Verbindungen nachgewiesen, die Komponenten des β2-Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalwegs hemmen können. Automatisierte Durchflusszytometer ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening. Die Identifizierung neuer Antagonisten kann nicht nur unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen, sondern auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte Anti-Entzündungstherapie liefern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrinaktivierung unter Verwendung von Antikörpern zu etablieren, die über Konformationsänderungen berichtende Antikörper und Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie verwenden. Die Methode kann auch als Leitfaden für andere antikörperbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methoden dienen. β2-Integrine sind Leukozyten-spezifische Adhäsionsmoleküle, die für die Immunantwort entscheidend sind. Neutrophile Granulozyten sind auf die Integrinaktivierung angewiesen, um den Blutkreislauf zu verlassen, nicht nur, um Infektionen zu bekämpfen, sondern auch, um an mehreren entzündlichen Erkrankungen beteiligt zu sein. Die Kontrolle der β2-Integrin-Aktivierung stellt einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von Neutrophilen-assoziierten Entzündungserkrankungen dar. In diesem Protokoll wird ein monoklonaler Antikörper, mAb24, der spezifisch an das hochaffine Kopfstück von β2-Integrinen bindet, verwendet, um die Aktivierung von β2-Integrinen auf isolierten primären humanen Neutrophilen zu quantifizieren. N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) wird als Stimulus zur Aktivierung neutrophiler β2-Integrine verwendet. In dieser Studie wurde ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometer verwendet, das in der Lage ist, 384-Well-Plattenproben automatisch durchzuführen. Die Auswirkungen von 320 Chemikalien auf die β2-Integrin-Hemmung werden innerhalb von 3 h untersucht. Auf diese Weise können Moleküle identifiziert werden, die direkt auf β2-Integrine abzielen oder auf Moleküle im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-initiierten Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalweg abzielen.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrin-Aktivierung 

Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Die Daten eines repräsentativen 384-Well-Plattenscreenings (Abbildung 4) zeigten, dass die Negativkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 3236 ± 110 aufwiesen, während die Positivkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 7588 ± 858 aufwiesen. Der Z'-Faktor für diese Platte beträgt ungefähr 0,33, was innerhalb eines akzeptablen Bereichs31 liegt. Z' erfordert jedoch eine weitere Validierung in sekundären Assays.
Um die Daten zu normalisie...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf neutrophile Integrine, und in dieser Studie wollen wir eine Methode etablieren, um kleine molekulare Antagonisten der Beta-2-Integrinaktivierung zu finden. Wir glauben, dass wir mit dieser Methode neue Antagonisten finden können, die unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen und auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte entzündungshemmende Therapie liefern können. In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, neue entzündungshemmende Medikamente zu entdecken und ihre Wirkmechanismen zu analysieren.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K Aufrufe.  UConn Health. Unsere Forschung konzentriert sich auf neutrophile Integrine, und in dieser Studie wollen wir eine Methode etablieren, um kleine molekulare Antagonisten der Beta-2-Integrinaktivierung zu finden. Wir glauben, dass wir mit dieser Methode neue Antagonisten finden können, die unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen und auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte entzündungshemmende Therapie liefern können. In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, neue entzündun...

Serie: Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrin-Aktivierung 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.