Nous remercions le Dr Evan Jellison et Mme Li Zhu du centre de cytométrie en flux de UConn Health pour leur aide en matière de cytométrie en flux, le Dr Lynn Puddington du département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments, Mme Slawa Gajewska et le Dr Paul Appleton du noyau de recherche clinique de UConn Health pour leur aide dans l’obtention d’échantillons de sang. Nous remercions le Dr Christopher « Kit » Bonin et la Dre Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour leur aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (P20GM121176), aux États-Unis, d’un prix de développement de carrière de l’American Heart Association (18CDA34110426) et d’un fonds de démarrage de UConn Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Des échantillons de sang total hépariné ont été obtenus auprès de donneurs humains sains anonymisés après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par l’Institutional Review Board de UConn Health, conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé de tous les donneurs a été obtenu. Les critères d’inclusion et d’exclusion de cette étude ont été soigneusement élaborés afin de s’assurer de la pertinence des participants et de minimiser les risques potentiels. Les participants admissibles étaient âgés de 18 à 65 ans, de toute origine ethnique, parlant couramment l’anglais et capables de donner un consentement éclairé. Les participants exclus comprenaient ceux qui n’étaient pas en mesure de donner un consentement éclairé pour eux-mêmes, comme ceux qui avaient besoin d’un représentant légalement autorisé, les personnes de moins de 18 ans ou de plus de 65 ans, les personnes incarcérées et les femmes enceintes. De plus, les participants devaient être exempts d’utilisation de médicaments anti-inflammatoires et de conditions inflammatoires. Les infections actuelles ou les affections inflammatoires chroniques ou aiguës persistantes étaient également des critères d’exclusion. Enfin, les personnes ayant des antécédents actuels ou récents d’infection à la COVID-19 n’étaient pas admissibles à l’étude. Ces critères ont été conçus pour assurer la sécurité et l’adéquation des participants tout en minimisant les facteurs de confusion potentiels qui pourraient avoir une incidence sur les résultats de l’étude.
1. Préparation des réactifs
<ol><li>Milieu neutrophile : Préparer le milieu neutrophile en ajoutant 2 % d’albumine sérique humaine au RPMI-1640 sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Solution de fMLP : Préparer la solution de fMLP en la diluant 100 fois à partir de la solution de stockage de 10 mM de diméthylsulfoxyde de diméthyle (DMSO) de fMLP (voir le tableau des matériaux) avec RPMI 1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une solution de 100 μM de fMLP.</li>
	<li>Solution d’anticorps : Diluer 120 μL d’anticorps monoclonal conjugué à l’allophycocyanine (APC) mAb24 (mAb24-APC) (voir le tableau des matériaux), qui fait état de la conformation de haute affinité de l’intégrine β2, dans 10 mL de milieu neutrophile, créant ainsi une solution de mAb24-APC à 1,2 μg/mL.</li>
	<li>Bibliothèque de composés : Diluer la bibliothèque initiale de composés avec une concentration de 10 mM à 1 mM en ajoutant 5 μL de la bibliothèque de 10 mM (voir le tableau des matériaux) à 45 μL de DMSO dans des plaques de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides. Par la suite, transférez 5 μL par puits de la bibliothèque de composés de 1 mM sur une plaque vide de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides.</li>
	<li>Comme l’illustre la figure 1, quatre colonnes (1, 2, 23, 24) ne contenaient que du DMSO, mais aucun composé, servant de témoins positifs et négatifs dans le criblage. Diluer davantage chaque puits en ajoutant 45 μL de RPMI-1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une concentration finale de 100 μM pour tous les composés.</li>
</ol>2. Isolement des neutrophiles du sang humain
<ol><li>À l’aide d’une pipette sérologique, superposer soigneusement 4 mL de sang sur 8 mL d’un milieu à gradient de densité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 15 mL (figure 2A).</li>
	<li>Centrifuger le sang à 550 × g pendant 30-50 min à 20 °C. Décélérez progressivement le rotor (facteur de décélération de 1). REMARQUE : La séparation réussie des neutrophiles (bande 2 de la figure 2B) des globules rouges peut varier d’un donneur à l’autre. Pour la plupart des donneurs, une centrifugation de 30 minutes suffit. Cependant, pour certains donneurs, une centrifugation supplémentaire de 10 à 30 minutes peut être nécessaire si la séparation n’est pas réussie (Figure 2C).</li>
	<li>Retirez délicatement le plasma (le liquide jaune sur le dessus) et les cellules mononucléées (la bande trouble supérieure ; PBMC de la figure 2B) à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Recueillir les neutrophiles de la bande trouble inférieure (bande des neutrophiles sur la figure 2B) et à environ 3 à 4 mL sous le liquide clair dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez délicatement la suspension de neutrophiles en l’inversant 2 à 3 fois.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 400 × g pendant 10 min à 20 °C, puis retirer délicatement le surnageant par décantation.</li>
	<li>Remettre délicatement la pastille en suspension avec 5 mL de PBS et la centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 20 °C.</li>
	<li>Retirez le surnageant en le décantant et éliminez soigneusement tout surnageant résiduel autour de l’embouchure du tube et sur la paroi du tube à l’aide d’une aspiration sous vide. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu neutrophile.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. En règle générale, 1 à 4 × 107 neutrophiles ont été obtenus à partir de 8 mL de sang humain. REMARQUE : Il peut y avoir une contamination par les globules rouges dans la suspension de neutrophiles. Les globules rouges n’affectent pas de manière significative la plupart des tests et peuvent empêcher l’activation/l’amorçage des neutrophiles27. Les globules rouges doivent être lysés avant d’être comptés pour obtenir une concentration précise de neutrophiles. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire à 891 μL d’eau déminéralisée pendant 10 à 30 s pour lyser les globules rouges, puis ajouter 99 μL de PBS 10× pour équilibrer la pression osmotique, empêchant ainsi la lyse des neutrophiles.</li>
	<li>Ajustez la densité cellulaire à 6,25 × 105 cellules/mL en ajoutant du milieu neutrophile.</li>
</ol>3. Préparation de la plaque à 384 puits
<ol><li>Dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, mélanger 1 mL de solution d’anticorps (1,2 μg/mL de mAb24-APC) avec 0,2 mL de milieu neutrophile pour créer une solution de mAb24-APC de 1 μg/mL. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins négatifs d’une plaque à 384 puits (les puits bleus de la figure 1).</li>
	<li>Dans un tube à centrifuger de 15 mL, mélanger 9 mL de la solution d’anticorps avec 21,6 μL de solution fMLP (100 μM) et 1,7784 mL de milieu neutrophile pour créer une solution contenant 1 μg/mL de mAb24-APC et 200 nM de fMLP. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins positifs et d’essai dans une plaque de 384 puits (les puits rouge et bleu de la figure 1).</li>
	<li>Transférez 5 μL des solutions composées de 100 μM de la plaque de la bibliothèque de composés à la plaque de 384 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Centrifuger le liquide pendant 1 min à 500 × g, à température ambiante. REMARQUE : Pour centrifuger les plaques, un rotor à godets oscillants et des godets à plaques sont nécessaires.</li>
</ol>4. Traitement des cellules
<ol><li>Ajouter 20 μL de suspension de neutrophiles dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (plage de 5 à 50 μL, pour chaque colonne de la plaque à 384 puits). Mélangez délicatement 5 à 10 fois à l’aide de la pipette, en maintenant un intervalle de temps constant entre chaque pipetage. NOTA : Les concentrations finales dans les puits sont les suivantes : neutrophiles 2,5 × 105 cellules/mL (tous les puits) ; mAb24-APC 0,5 μg/mL (tous les puits) ; fMLP 100 nM (puits de contrôle positif et d’essai) ; composés 10 μM (puits d’essai).</li>
	<li>Incuber la plaque sur un shaker à 300 tr/min, à température ambiante (RT), pendant 10 min.</li>
	<li>Fixez les cellules en ajoutant 3 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (concentration finale de PFA ~0,91 %). Ensuite, incuber sur glace pendant 10 min. REMARQUE : Il est recommandé de maintenir un intervalle de temps constant entre les différentes colonnes lors de l’ajout de neutrophiles et de PFA. Cela garantit que les neutrophiles de chaque puits ont le même temps d’incubation avec fMLP et mAb24-APC.</li>
</ol>5. Cytométrie en flux
<ol><li>Mettez le cytomètre en flux sous tension (voir Tableau des matériaux) et assurez-vous que l’ordinateur connecté à l’instrument est également allumé.</li>
	<li>Assurez-vous que le réservoir de liquide de la gaine est rempli et que le conteneur à déchets est vide et correctement connecté à l’instrument.</li>
	<li>Chargez la plaque à 384 puits sur le chargeur d’échantillons du cytomètre en flux. Assurez-vous que le puits A1 de la plaque est aligné avec le repère A1 sur le chargeur.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel et créez une nouvelle expérience. Sélectionnez le puits 384 et choisissez les fluorophores souhaités. Ensuite, cliquez sur Configuration de la plaque, faites glisser pour sélectionner tous les puits, puis cliquez sur Échantillon. Activez le commutateur « Débit élevé » et sélectionnez Haut sous le panneau de débit.<ol><li>Dans la zone de volume, entrez 50. Sélectionnez les échantillons dans des colonnes impaires, puis activez le commutateur « Agitation ». Enfin, nommez les échantillons dans le panneau de droite.</li>
	</ol></li>
	<li>Cliquez sur Tracer et porte. Ensuite, cliquez sur le bouton Appliquer (deux flèches sur un cercle rempli de vert), puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire). Attendez quelques secondes pour observer quelques cellules du premier puits, puis cliquez sur le bouton pause .<ol><li>Ajustez les tensions FSC et SSC pour assurer une bonne visualisation des cellules sur le tracé. Cliquez sur Acquisition, puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire) pour lancer le test.</li>
	</ol></li>
	<li>Le cytomètre en flux échantillonnera séquentiellement ~50 μL de 1000 à 3000 neutrophiles de chaque puits. Il faudra environ 3 h pour compléter l’ensemble de la plaque de 384 puits.</li>
	<li>Une fois tous les exemples terminés, exportez les fichiers .fcs pour passer à l’étape suivante.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux (voir Table des matériaux). Sélectionnez et faites glisser le dossier contenant tous les fichiers .fcs dans la fenêtre du logiciel, puis relâchez-le pour importer les données dans le logiciel.</li>
	<li>Double-cliquez sur un échantillon, mettez en grille les neutrophiles simples basés sur FSC et SSC28,29,30 dans la fenêtre contextuelle, comme illustré à la figure 3. Sélectionnez les lignes fermées et faites-les glisser vers le dossier, puis relâchez-les pour appliquer la barrière à tous les échantillons de ce dossier.</li>
	<li>Calculez et exportez l’intensité de fluorescence médiane (MFI) APC des neutrophiles de chaque puits à l’aide de la fonction d’édition de table du logiciel. Cliquez sur Ajouter une colonne sous l’onglet Modifier . Sélectionnez Médiane dans l’onglet Statistique , choisissez les neutrophiles de population contrôlés, puis sélectionnez APC comme paramètre. Cliquez sur le bouton OK .</li>
	<li>Retournez à l’onglet « Editeur de table », sélectionnez Tous les échantillons dans l’onglet « Groupe » et appuyez sur le bouton Créer une table . Une nouvelle fenêtre apparaîtra affichant le tableau créé. Enregistrez-le sous forme de fichier texte, CSV ou Excel.</li>
	<li>Ouvrez le tableau exporté, calculez la valeur moyenne et l’écart-type de l’IMF APC pour les échantillons témoins positifs et négatifs (Figure 4).</li>
	<li>Calculer le facteur Z' (Z') de la plaque à l’aide de l’équation : Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), où σ p et σ n sont les écarts-types des témoins positifs et négatifs, respectivement, et μp et μn sont les moyennes des témoins positifs et négatifs, respectivement31. NOTE : Le facteur Z' indique la séparation des distributions de contrôle positives et négatives. Un Z' de 0 signifie qu’il n’y a pas de séparation, tandis qu’un Z' de 0,5 indique une séparation égale. Comme mentionné dans une étude précédente31, le > de Z de 0,5 indique un excellent test pour le criblage des composés. Un Z' compris entre 0,5 et 0 est acceptable, mais il se peut qu’il n’identifie que des résultats forts dans le test, ce qui nécessitera une validation supplémentaire dans les tests secondaires.</li>
	<li>Considérer les composés comme des « résultats » pour le criblage lorsque l’IMF APC des neutrophiles traités par composé est inférieur à trois fois l’écart-type de l’IMF témoin positif soustrait de l’IMF témoin positif (P = 0,0013, représenté par la ligne pointillée de la figure 4).</li>
</ol>

Criblage d’inhibiteurs de l’activation de l’intégrine β2 dans les neutrophiles humains

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

L’initiation et l’arrêt de la stimulation et de la coloration des neutrophiles sont déterminés par l’ajout de neutrophiles et du PFA fixateur. Par conséquent, il est essentiel d’assurer le même intervalle de temps entre le pipetage des neutrophiles ou de l’APF dans chaque colonne. Cela garantit que le temps de stimulation et de coloration des neutrophiles de chaque puits reste constant. En raison de la courte durée de vie des neutrophiles, l’ensemble de l’expérience, de la collecte de sang des donneu...

De nombreuses maladies inflammatoires sont caractérisées par l’infiltration de neutrophiles sur le site d’un gonflement ou d’une blessure1. Pour infiltrer ces tissus, les neutrophiles doivent compléter la cascade de recrutement des neutrophiles, qui implique l’arrêt de l’endothélium, l’extravasation à travers la paroi du vaisseau et le recrutement dans le tissu2. Les neutrophiles circulants ont besoin de l’activation de l’intégrine β2 pour compléter cette cascade, en particulier pour la phase d’arrêt. Ainsi, les médicaments inhibiteurs de l’intégrine qui réduisent l’adhésion, l’extravasation et le recrutement des neutrophiles peuvent traiter efficacement les maladies inflammatoires 3,4.
Les intégrines β2 ont déjà été ciblées pour des maladies inflammatoires. L’efalizumab, un anticorps monoclonal ciblant directement l’intégrine αLβ2, a été développé pour traiter le psoriasis5. Cependant, l’efalizumab a été retiré en raison de son effet secondaire mortel - une leucoencéphalopathie multifocale progressive résultant de la réactivation du virus JC 6,7. Les nouveaux traitements anti-inflammatoires à base d’intégrine devraient envisager de maintenir les fonctions anti-infectieuses des leucocytes afin de minimiser les effets secondaires. Les effets secondaires de l’efalizumab pourraient être dus à la circulation prolongée d’anticorps monoclonaux dans le sang, ce qui pourrait inhiber les fonctions immunitaires à long terme8. Une étude récente montre que l’efalizumab intervient dans la réticulation de l’αLβ2 et l’internalisation indésirable des intégrines α4, fournissant une explication alternative des effets secondaires9. Ainsi, les antagonistes à petites molécules à courte durée de vie pourraient éviter ce problème.
Une méthode à haut débit pour cribler les antagonistes de l’intégrine β2 de petites molécules à l’aide de neutrophiles humains est présentée ici. L’activation de l’intégrine β2 nécessite des changements conformationnels de l’ectodomaine de l’intégrine pour accéder à son ligand et augmenter son affinité de liaison avec celui-ci. Dans le modèle canonique à cran d’arrêt, l’ectodomaine de l’intégrine courbée-fermée s’étend d’abord jusqu’à une conformation étendue-fermée, puis ouvre sa coiffe à une conformation ouverte-étendue entièrement activée10,11,12,13. Il existe également une voie alternative qui part de la fermeture courbée à l’ouverture courbée et à l’ouverture étendue, éventuellement 14,15,16,17,18,19. L’anticorps spécifique de la conformation mAb24 se lie à un épitope dans le domaine humain de type β2-I lorsque la coiffe de l’ectodomaine est ouverte20,21,22,23.
Ici, mAb24-APC est utilisé pour déterminer si les intégrines β2 sont activées. Pour activer les neutrophiles et l’intégrine, la N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP), un peptide chimiotactique court d’origine bactérienne capable d’activer les intégrines β2 des neutrophiles24, est utilisée comme stimulus dans ce protocole. Lorsque fMLP se lie à Fpr1 sur les neutrophiles, des cascades de signalisation en aval impliquant des protéines G, la phospholipase Cβ et la phosphoinositide 3-kinase γ sont activées. Ces événements de signalisation aboutissent finalement à l’activation de l’intégrine via la voie de signalisation de l’intérieur vers l’extérieur18,25. Outre les antagonistes de petites molécules qui se lient directement aux intégrines β2 et empêchent les changements conformationnels de l’activation de l’intégrine26, des composés capables d’inhiber les composants de la voie de signalisation d’activation de l’intégrine β2 de l’intérieur vers l’extérieur seraient également détectés avec cette méthode. Les cytomètres en flux automatisés permettent un criblage à haut débit. L’identification de nouveaux antagonistes peut non seulement approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, mais aussi fournir des informations translationnelles sur le traitement anti-inflammatoire à base d’intégrine.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Ce protocole vise à établir une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2, en utilisant des anticorps rapporteurs de changement conformationnel et une cytométrie en flux à haut débit. La méthode peut également servir de guide pour d’autres méthodes de criblage à haut débit à base d’anticorps. Les intégrines β2 sont des molécules d’adhésion spécifiques aux leucocytes qui sont cruciales dans les réponses immunitaires. Les neutrophiles dépendent de l’activation de l’intégrine pour sortir de la circulation sanguine, non seulement pour combattre les infections, mais aussi pour être impliqués dans de multiples maladies inflammatoires. Le contrôle de l’activation de l’intégrine β2 présente une approche viable pour le traitement des maladies inflammatoires associées aux neutrophiles. Dans ce protocole, un anticorps monoclonal, mAb24, qui se lie spécifiquement à la coiffe de haute affinité des intégrines β2, est utilisé pour quantifier l’activation de l’intégrine β2 sur des neutrophiles humains primaires isolés. La N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) est utilisée comme stimulus pour activer les intégrines β2 des neutrophiles. Un cytomètre en flux à haut débit capable d’analyser automatiquement des échantillons de plaques à 384 puits a été utilisé dans cette étude. Les effets de 320 produits chimiques sur l’inhibition de l’intégrine β2 sont évalués dans les 3 heures. Les molécules qui ciblent directement les intégrines β2 ou les molécules cibles dans la voie de signalisation d’activation de l’intégrine initiée par le récepteur couplé aux protéines G peuvent être identifiées grâce à cette approche.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2 

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

Les données d’un criblage représentatif de plaques à 384 puits (Figure 4) ont révélé que les témoins négatifs avaient une MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, tandis que les témoins positifs avaient une MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. Le facteur Z' de cette plaque est d’environ 0,33, ce qui se situe dans une plage acceptablede 31. Cependant, Z' nécessite une validation supplémentaire dans les tests secondaires.
Pour normaliser l...

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Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Notre recherche est axée sur l’intégrine neutrophile, et dans cette étude, nous visons à établir une méthode pour trouver de petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine bêta-2. Nous pensons qu’avec cette méthode, nous pouvons trouver de nouveaux antagonistes qui pourraient approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, et également fournir un aperçu translationnel de la thérapie anti-inflammatoire à base d’intégrine. À l’avenir, nous nous concentrerons sur la découverte de nouveaux anti-inflammatoires et la dissection de leurs mécanismes d’action.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K vues.  UConn Health. Notre recherche est axée sur l’intégrine neutrophile, et dans cette étude, nous visons à établir une méthode pour trouver de petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine bêta-2. Nous pensons qu’avec cette méthode, nous pouvons trouver de nouveaux antagonistes qui pourraient approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, et également fournir un aperçu translationnel de la thérapie anti-inflammatoire à base d’intégrine. À l’a...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.