Ringraziamo il Dr. Evan Jellison e la Sig.ra Li Zhu nel nucleo di citometria a flusso presso UConn Health per la loro assistenza con la citometria a flusso, la Dott.ssa Lynn Puddington nel Dipartimento di Immunologia presso UConn Health per il suo supporto agli strumenti, la Sig.ra Slawa Gajewska e il Dr. Paul Appleton nel nucleo di ricerca clinica presso UConn Health per il loro aiuto nell'ottenere campioni di sangue. Ringraziamo il Dr. Christopher "Kit" Bonin e la Dr.ssa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il loro aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health, del National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), del National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, di un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Heart Association (18CDA34110426) e di un fondo di avvio di UConn Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani non identificati dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health, seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori. I criteri di inclusione/esclusione per questo studio sono stati accuratamente sviluppati per garantire l'idoneità dei partecipanti e per ridurre al minimo i rischi potenziali. I partecipanti idonei avevano un'età compresa tra i 18 e i 65 anni, di qualsiasi etnia, parlavano fluentemente l'inglese e erano in grado di fornire il consenso informato. I partecipanti esclusi includevano coloro che non erano in grado di fornire il consenso informato per se stessi, come quelli che richiedono un rappresentante legalmente autorizzato, individui di età inferiore ai 18 anni o superiore ai 65 anni, individui incarcerati e donne incinte. Inoltre, i partecipanti dovevano essere liberi dall'uso di farmaci antinfiammatori e dalle condizioni infiammatorie. Anche le infezioni in corso o le condizioni infiammatorie croniche o acute in corso erano criteri di esclusione. Infine, gli individui con una storia attuale o recente di infezione da COVID-19 non erano idonei per lo studio. Questi criteri sono stati progettati per garantire la sicurezza e l'idoneità dei partecipanti, riducendo al minimo i potenziali fattori confondenti che potrebbero influire sui risultati dello studio.
1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Terreno neutrofilo: Preparare il terreno neutrofilo aggiungendo il 2% di albumina sierica umana a RPMI-1640 senza rosso fenolo (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Soluzione fMLP: Preparare la soluzione fMLP diluendola 100 volte dalla soluzione di conservazione a 10 mM di fMLP dimetilsolfossido (DMSO) (vedere Tabella dei materiali) con RPMI 1640 senza rosso fenolo, ottenendo una soluzione fMLP da 100 μM.</li>
	<li>Soluzione anticorpale: diluire 120 μL di anticorpo monoclonale coniugato alloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (vedi tabella dei materiali), che riporta la conformazione ad alta affinità dell'integrina β2, in 10 mL di terreno neutrofilo, creando una soluzione di 1,2 μg/mL di mAb24-APC.</li>
	<li>Libreria di composti: diluire la libreria di composti iniziale con una concentrazione compresa tra 10 mM e 1 mM aggiungendo 5 μL della libreria di 10 mM (vedere la tabella dei materiali) a 45 μL di DMSO in piastre da 384 pozzetti utilizzando il manipolatore di liquidi. Successivamente, trasferire 5 μL per pozzetto della libreria di composti da 1 mM su una piastra vuota da 384 pozzetti utilizzando il gestore di liquidi.</li>
	<li>Come illustrato nella Figura 1, quattro colonne (1, 2, 23, 24) contenevano solo DMSO ma nessun composto, che fungeva da controlli positivi e negativi nello screening. Diluire ulteriormente ciascun pozzetto aggiungendo 45 μL di RPMI-1640 senza rosso fenolo, ottenendo una concentrazione finale di 100 μM per tutti i composti.</li>
</ol>2. Isolamento dei neutrofili dal sangue umano
<ol><li>Utilizzando una pipetta sierologica, stratificare accuratamente 4 mL di sangue su 8 mL di un terreno a gradiente di densità disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 15 mL (Figura 2A).</li>
	<li>Centrifugare il sangue a 550 × g per 30-50 minuti a 20 °C. Decelerare gradualmente il rotore (fattore di decelerazione pari a 1). NOTA: L'esito positivo della separazione dei neutrofili (banda 2 nella Figura 2B) dai globuli rossi può variare da un donatore all'altro. Per la maggior parte dei donatori, è sufficiente una centrifugazione di 30 minuti. Tuttavia, per alcuni donatori, possono essere necessari altri 10-30 minuti di centrifugazione se la separazione non ha successo (Figura 2C).</li>
	<li>Rimuovere con cautela il plasma (il liquido giallo in alto) e le cellule mononucleate (la fascia torbida superiore; PBMC nella Figura 2B) utilizzando una pipetta da 1 mL.</li>
	<li>Raccogliere i neutrofili dalla banda torbida inferiore (banda dei neutrofili nella Figura 2B) e circa 3-4 mL sotto il liquido limpido in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolare delicatamente la sospensione di neutrofili capovolgendola 2-3 volte.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 400 × g per 10 minuti a 20 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante mediante travaso.</li>
	<li>Risospendere delicatamente il pellet con 5 mL di PBS e centrifugarlo a 300 × g per 5 min a 20 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante mediante decantazione ed eliminare con cautela eventuali residui di surnatante intorno all'imboccatura del tubo e sulla parete del tubo utilizzando l'aspirazione a vuoto. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno neutrofilo.</li>
	<li>Contare i numeri delle cellule usando un emocitometro. Tipicamente, da 1 a 4 × 107 neutrofili sono stati ottenuti da 8 mL di sangue umano. NOTA: Potrebbe esserci una contaminazione dei globuli rossi nella sospensione di neutrofili. I globuli rossi non influenzano in modo significativo la maggior parte dei test e possono prevenire l'attivazione/priming dei neutrofili27. I globuli rossi devono essere lisati prima di contare per ottenere una concentrazione accurata di neutrofili. Aggiungere 10 μL di sospensione cellulare a 891 μL di acqua deionizzata per 10-30 s per lisare i globuli rossi, quindi aggiungere 99 μL di PBS al 10× per bilanciare la pressione osmotica, prevenendo la lisi dei neutrofili.</li>
	<li>Regolare la densità cellulare a 6,25 × 105 cellule/mL aggiungendo terreno neutrofilo.</li>
</ol>3. Preparazione della piastra a 384 pozzetti
<ol><li>In una provetta da centrifuga da 1,5 mL, combinare 1 mL della soluzione anticorpale (1,2 μg/mL di mAb24-APC) con 0,2 mL di terreno neutrofilo per creare una soluzione di mAb24-APC da 1 μg/mL. Quindi, aggiungere 25 μL di questa miscela ai pozzetti di controllo negativo in una piastra da 384 pozzetti (i pozzetti blu nella Figura 1).</li>
	<li>In una provetta da centrifuga da 15 mL, miscelare 9 mL della soluzione anticorpale con 21,6 μL della soluzione fMLP (100 μM) e 1,7784 mL di terreno neutrofilo per creare una soluzione contenente 1 μg/mL di mAb24-APC e 200 nM di fMLP. Successivamente, aggiungere 25 μL di questa miscela ai pozzetti di controllo positivo e di prova in una piastra da 384 pozzetti (i pozzetti rosso e blu nella Figura 1).</li>
	<li>Trasferire 5 μL delle soluzioni composte da 100 μM dalla piastra della libreria composta alla piastra da 384 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Centrifugare il liquido per 1 min a 500 × g, a temperatura ambiente. NOTA: Per centrifugare le piastre, sono necessari un rotore a secchiello oscillante e secchi a piastre.</li>
</ol>4. Trattamento delle cellule
<ol><li>Aggiungere 20 μL della sospensione di neutrofili a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a 16 canali (intervallo 5-50 μL, per ciascuna colonna della piastra a 384 pozzetti). Miscelare delicatamente 5-10 volte utilizzando la pipetta, mantenendo un intervallo di tempo costante tra un pipettaggio e l'altro. NOTA: Le concentrazioni finali nei pozzetti sono le seguenti: neutrofili 2,5 × 105 cellule/mL (tutti i pozzetti); mAb24-APC 0,5 μg/mL (tutti i pozzetti); fMLP 100 nM (pozzetti di controllo positivo e di prova); composti 10 μM (pozzetti di prova).</li>
	<li>Incubare la piastra su uno shaker a 300 giri/min, a temperatura ambiente (RT), per 10 min.</li>
	<li>Fissare le cellule aggiungendo 3 μL di paraformaldeide (PFA) al 16% a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a 16 canali (concentrazione finale di PFA ~0,91%). Quindi, incubare su ghiaccio per 10 minuti. NOTA: Si raccomanda di mantenere un intervallo di tempo costante tra le diverse colonne quando si aggiungono neutrofili e PFA. Ciò garantisce che i neutrofili in ciascun pozzetto abbiano lo stesso tempo di incubazione con fMLP e mAb24-APC.</li>
</ol>5. Citometria a flusso
<ol><li>Accendere il citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali) e assicurarsi che anche il computer collegato allo strumento sia acceso.</li>
	<li>Assicurarsi che il contenitore del fluido della guaina sia pieno e che il contenitore dei rifiuti sia vuoto e collegato correttamente allo strumento.</li>
	<li>Caricare la piastra a 384 pozzetti sul caricatore di campioni del citometro a flusso. Assicurarsi che il pozzetto A1 della piastra sia allineato con il segno A1 sul caricatore.</li>
	<li>Apri il software e crea un nuovo esperimento. Selezionare 384 pozzetti e scegliere i fluorofori desiderati. Quindi, fare clic su Impostazione piastra, trascinare per selezionare tutti i pozzetti, quindi fare clic su Campione. Attiva l'interruttore "Throughput elevato" e seleziona Alto nel pannello della velocità.<ol><li>Nella casella del volume, immettere 50. Selezionare i campioni nelle colonne dispari, quindi attivare l'interruttore "Agitazione". Infine, assegna un nome agli esempi nel pannello di destra.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare clic su Trama e cancello. Quindi, fai clic sul pulsante Applica (due frecce su un cerchio pieno di verde) e, successivamente, fai clic sul pulsante di riproduzione (forma triangolare). Attendi qualche secondo per osservare alcune cellule dal primo pozzetto, quindi fai clic sul pulsante di pausa .<ol><li>Regolare le tensioni FSC e SSC per garantire una corretta visualizzazione delle celle sul grafico. Fare clic su Acquisizione, quindi fare clic sul pulsante di riproduzione (forma triangolare) per avviare il saggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Il citometro a flusso campiona sequenzialmente ~50 μL di 1000-3000 neutrofili da ciascun pozzetto. Ci vorranno circa 3 ore per completare l'intera piastra da 384 pozzetti.</li>
	<li>Dopo aver completato tutti gli esempi, esportare i file con estensione fcs per il passaggio successivo.</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Aprire il software di analisi dei dati di citometria a flusso (vedere Tabella dei materiali). Selezionare e trascinare la cartella contenente tutti i file .fcs nella finestra del software, quindi rilasciare per importare i dati nel software.</li>
	<li>Fare doppio clic su un campione, gate singoli neutrofili basati su FSC e SSC28,29,30 nella finestra che si apre, come mostrato nella Figura 3. Selezionare le righe controllate e trascinarle nella cartella, quindi rilasciare per applicare il controllo a tutti gli esempi in tale cartella.</li>
	<li>Calcola ed esporta l'intensità di fluorescenza mediana (MFI) APC dei neutrofili da ciascun pozzetto utilizzando la funzione di editor di tabelle del software. Fare clic su Aggiungi colonna nella scheda Modifica . Selezionare Mediana nella scheda Statistica , scegliere i neutrofili della popolazione gated e selezionare APC come parametro. Fare clic sul pulsante OK .</li>
	<li>Torna alla scheda "Editor di tabelle", seleziona Tutti i campioni nella scheda "Gruppo" e premi il pulsante Crea tabella . Apparirà una nuova finestra che mostra la tabella creata. Salvalo come file di testo, CSV o Excel.</li>
	<li>Aprire la tabella esportata, calcolare il valore medio e la deviazione standard dell'MFI APC per i campioni di controllo positivi e negativi (Figura 4).</li>
	<li>Calcola il fattore Z' (Z') della piastra usando l'equazione: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), dove σ p e σ n sono rispettivamente le deviazioni standard dei controlli positivi e negativi e μp e μn sono le medie dei controlli positivi e negativi31. NOTA: Il fattore Z' indica la separazione delle distribuzioni di controllo positive e negative. Una Z' di 0 significa nessuna separazione, mentre una Z' di 0,5 indica una separazione uguale. Come accennato in un precedente studio31, Z' > 0,5 indica un test eccellente per lo screening dei composti. Una Z' nell'intervallo da 0,5 a 0 è accettabile, ma può identificare solo forti riscontri positivi nel saggio, che richiederanno un'ulteriore convalida nei saggi secondari.</li>
	<li>Considerare i composti come "hit" per lo screening quando l'MFI APC dei neutrofili trattati con il composto è inferiore a tre volte la deviazione standard dell'MFI di controllo positivo sottratta dall'MFI di controllo positivo (P = 0,0013, rappresentato dalla linea tratteggiata nella Figura 4).</li>
</ol>

Screening degli inibitori dell'attivazione dell'integrina β2 nei neutrofili umani

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'inizio e la fine della stimolazione e della colorazione dei neutrofili sono determinati dall'aggiunta di neutrofili e del fissativo PFA. Pertanto, è fondamentale garantire lo stesso intervallo di tempo tra il pipettaggio dei neutrofili o del PFA in ciascuna colonna. Ciò garantisce che il tempo di stimolazione e colorazione dei neutrofili da ciascun pozzetto rimanga costante. A causa della breve durata di vita dei neutrofili, l'intero esperimento, dalla raccolta del sangue dai donatori al completamento della citometri...

Molte malattie infiammatorie sono caratterizzate dall'infiltrazione di neutrofili nel sito di gonfiore o lesione1. Per infiltrarsi in questi tessuti, i neutrofili devono completare la cascata di reclutamento dei neutrofili, che comporta l'arresto dell'endotelio, lo stravaso attraverso la parete del vaso e il reclutamento nel tessuto2. I neutrofili circolanti hanno bisogno dell'attivazione dell'integrina β2 per completare questa cascata, specialmente per la fase di arresto. Pertanto, i farmaci inibitori dell'integrina che riducono l'adesione, lo stravaso e il reclutamento dei neutrofili possono trattare efficacemente le malattie infiammatorie 3,4.
Le integrine β2 sono già state prese di mira per le malattie infiammatorie. Efalizumab, un anticorpo monoclonale che ha come bersaglio diretto l'integrina αLβ2, è stato sviluppato per il trattamento della psoriasi5. Tuttavia, efalizumab è stato sospeso a causa del suo effetto collaterale letale: leucoencefalopatia multifocale progressiva derivante dalla riattivazione del virus JC 6,7. Le nuove terapie antinfiammatorie a base di integrine dovrebbero prendere in considerazione il mantenimento delle funzioni anti-infezione dei leucociti per ridurre al minimo gli effetti collaterali. Gli effetti collaterali di efalizumab potrebbero essere dovuti alla circolazione prolungata di anticorpi monoclonali nel flusso sanguigno, che potrebbero inibire le funzioni immunitarie a lungo termine8. Uno studio recente mostra che efalizumab media la reticolazione di αLβ2 e l'internalizzazione indesiderata delle integrine α4, fornendo una spiegazione alternativa per gli effetti collaterali9. Pertanto, gli antagonisti di piccole molecole di breve durata potrebbero evitare questo problema.
Di seguito viene presentato un metodo ad alto rendimento per lo screening di antagonisti dell'integrina β2 a piccole molecole utilizzando neutrofili umani. L'attivazione dell'integrina β2 richiede cambiamenti conformazionali dell'ectodominio dell'integrina per ottenere l'accesso e aumentare la sua affinità di legame con il suo ligando. Nel modello canonico a serramanico, l'ectodominio integrinico piegato-chiuso si estende prima a una conformazione estesa-chiusa e poi apre il suo copricapo a una conformazione estesa-aperta completamente attivata10,11,12,13. C'è anche un percorso alternativo che parte dal piegato-chiuso al piegato-aperto e all'esteso-aperto, infine 14,15,16,17,18,19. L'anticorpo conformazionale specifico mAb24 si lega a un epitopo nel dominio β2-I-like umano quando il copricapo dell'ectodominio è aperto20,21,22,23.
In questo caso, mAb24-APC viene utilizzato per determinare se le integrine β2 sono attivate. Per attivare i neutrofili e l'integrina, la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un peptide chemiotattico corto di derivazione batterica in grado di attivare le integrine β2 dei neutrofili24, viene utilizzato come stimolo in questo protocollo. Quando la fMLP si lega alla Fpr1 sui neutrofili, vengono attivate cascate di segnalazione a valle che coinvolgono le proteine G, la fosfolipasi Cβ e la fosfoinositide 3-chinasi γ. Questi eventi di segnalazione alla fine provocano l'attivazione dell'integrina attraverso la via di segnalazione inside-out18,25. Oltre agli antagonisti di piccole molecole che si legano direttamente alle integrine β2 e prevengono i cambiamenti conformazionali dell'attivazione delle integrine26, con questo metodo verrebbero rilevati anche composti che possono inibire i componenti nella via di segnalazione di attivazione dell'integrina β2 inside-out. I citometri a flusso automatizzati consentono uno screening ad alta produttività. L'identificazione di nuovi antagonisti può non solo approfondire la nostra comprensione della fisiologia delle integrine, ma anche fornire informazioni traslazionali sulla terapia antinfiammatoria a base di integrine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Questo protocollo mira a stabilire un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina β2, utilizzando anticorpi conformazionali che segnalano cambiamenti e citometria a flusso ad alto rendimento. Il metodo può anche fungere da guida per altri metodi di screening ad alto rendimento basati su anticorpi. Le integrine β2 sono molecole di adesione specifiche per i leucociti che sono cruciali nelle risposte immunitarie. I neutrofili si affidano all'attivazione delle integrine per uscire dal flusso sanguigno, non solo per combattere le infezioni, ma anche per essere coinvolti in molteplici malattie infiammatorie. Il controllo dell'attivazione dell'integrina β2 rappresenta un approccio praticabile per il trattamento delle malattie infiammatorie associate ai neutrofili. In questo protocollo, un anticorpo monoclonale, mAb24, che si lega specificamente al copricapo ad alta affinità delle integrine β2, viene utilizzato per quantificare l'attivazione dell'integrina β2 su neutrofili umani primari isolati. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) viene utilizzata come stimolo per attivare le integrine β2 dei neutrofili. In questo studio è stato utilizzato un citometro a flusso ad alto rendimento in grado di eseguire automaticamente campioni di piastre a 384 pozzetti. Gli effetti di 320 sostanze chimiche sull'inibizione dell'integrina β2 sono valutati entro 3 ore. Attraverso questo approccio è possibile identificare le molecole che prendono di mira direttamente le integrine β2 o le molecole bersaglio nella via di segnalazione di attivazione inside-out dell'integrina avviata dal recettore accoppiato alla proteina G.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina β2 

Una tecnica ad alto rendimento basata sulla citometria a flusso per lo screening di farmaci inibitori delle integrine

Our research is focused on neutrophil integrin, and in this study we aim to establish a method to find small molecular antagonists of Beta-2 integrin activation. We believe with this method we can find new antagonists that may deepen our understanding in integrin physiology, and also provide translational insight into integrin-based anti-inflammatory therapy. In the future, we will focus on discovering new anti-inflammatory drugs and dissecting their mechanisms of action.

I dati di uno screening rappresentativo su piastra a 384 pozzetti (Figura 4) hanno rivelato che i controlli negativi avevano un MFI di mAb24-APC di 3236 ± 110, mentre i controlli positivi avevano un MFI di mAb24-APC di 7588 ± 858. Il fattore Z' per questa piastra è di circa 0,33, che rientra in un intervallo accettabile31. Tuttavia, Z' richiede un'ulteriore convalida nei saggi secondari.
Per normalizzare i dati, tutti i valori sono stati...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of β2 Integrin Activation at JoVE.com

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 sui neutrofili umani.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

La nostra ricerca è focalizzata sull'integrina neutrofila e in questo studio miriamo a stabilire un metodo per trovare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina Beta-2. Crediamo che con questo metodo possiamo trovare nuovi antagonisti che possono approfondire la nostra comprensione della fisiologia delle integrine e anche fornire informazioni traslazionali sulla terapia antinfiammatoria a base di integrine. In futuro, ci concentreremo sulla scoperta di nuovi farmaci antinfiammatori e sull'analisi dei loro meccanismi d'azione.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.0K Views.  UConn Health. La nostra ricerca è focalizzata sull'integrina neutrofila e in questo studio miriamo a stabilire un metodo per trovare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina Beta-2. Crediamo che con questo metodo possiamo trovare nuovi antagonisti che possono approfondire la nostra comprensione della fisiologia delle integrine e anche fornire informazioni traslazionali sulla terapia antinfiammatoria a base di integrine. In futuro, ci concentreremo sulla scoperta di nuovi farmaci anti...