UConn HealthのフローサイトメトリーコアのEvan Jellison博士とLi Zhu氏にはフローサイトメトリーの支援を、UConn Healthの免疫学部門のLynn Puddington博士には機器のサポートを、UConn Healthの臨床研究コアには血液サンプルの採取に協力していただいたSlawa Gajewska氏とPaul Appleton博士に感謝します。UConn School of MedicineのChristopher "Kit" Bonin博士とGeneva Hargis博士には、この原稿の科学的執筆と編集に協力していただいたことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所、国立心肺血液研究所(R01HL145454)、米国国立総合医学研究所(P20GM121176)、米国心臓協会からのキャリア開発賞(18CDA34110426)、およびUConn Healthからのスタートアップ資金の支援を受けました。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

ヘパリン処理された全血サンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って、UConn Health の治験審査委員会によって承認されたインフォームド コンセントを取得した後、匿名化された健康な人間のドナーから採取されました。すべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。この研究の選択/除外基準は、参加者の適合性を確保し、潜在的なリスクを最小限に抑えるために慎重に開発されました。適格な参加者は、18歳から65歳で、あらゆる民族で、英語に堪能で、インフォームドコンセントを提供できる人でした。除外された参加者には、法的に権限のある代理人を必要とする人、18歳未満または65歳以上の個人、投獄された個人、妊娠中の女性など、自分でインフォームドコンセントを提供できない人が含まれていました。さらに、参加者は抗炎症薬の使用や炎症状態から解放されている必要がありました。現在の感染症または進行中の慢性または急性炎症状態も除外基準でした。最後に、COVID-19感染の既往歴がある人または最近の人は、この研究に不適格でした。これらの基準は、研究結果に影響を与える可能性のある潜在的な交絡因子を最小限に抑えながら、参加者の安全性と適合性を確保するように設計されています。
1. 試薬の調製
<ol><li>好中球培地:フェノールレッドを含まないRPMI-1640に2%ヒト血清アルブミンを添加して好中球培地を調製します( 材料表を参照)。</li>
	<li>fMLP溶液:10 mM fMLPジメチルスルホキシド(DMSO)保存溶液( 資料表を参照)を、フェノールレッドを含まないRPMI 1640で100倍に希釈してfMLP溶液を調製し、100 μMのfMLP溶液を生成します。</li>
	<li>抗体溶液:β2インテグリンの高親和性コンフォメーションを報告するアロフィコシアニン(APC)標識モノクローナル抗体mAb24(mAb24-APC)( 資料表参照)120 μLを10 mLの好中球培地で希釈し、1.2 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。</li>
	<li>化合物ライブラリー:リキッドハンドラーを使用して、384ウェルプレート中のDMSO45 μLに10 mMライブラリー( 材料表を参照)5 μLを添加することにより、最初の化合物ライブラリーを10 mM〜1 mMの濃度で希釈します。続いて、リキッドハンドラーを使用して、1 mM 化合物ライブラリーのウェルあたり 5 μL を空の 384 ウェルプレートに移します。</li>
	<li>図 1 に示すように、4 つのカラム( 1、2、23、24)には DMSO のみが含まれ、化合物は含まれておらず、スクリーニングのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能しました。フェノールレッドを含まないRPMI-1640を45μL添加して各ウェルをさらに希釈し、すべての化合物の最終濃度を100μMにします。</li>
</ol>2. ヒト血液からの好中球分離
<ol><li>血清ピペットを使用して、市販の密度勾配培地( 材料表を参照)8 mLの上に4 mLの血液を15 mLの遠心分離チューブに慎重に重ねます(図2A)。</li>
	<li>血液を550 × g で20°Cで30〜50分間遠心分離します。 ローターを徐々に減速します(減速係数1)。 注:赤血球からの好中球( 図2Bのバンド2)の分離の成功は、ドナーによって異なる場合があります。ほとんどのドナーでは、30分間の遠心分離で十分です。ただし、一部のドナーでは、分離が成功しない場合、さらに10〜30分の遠心分離が必要になる場合があります(図2C)。</li>
	<li>血漿(上部の黄色い液体)と単核細胞(上部の曇ったバンド; 図2BのPBMCバンド)を1mLのピペットで使用しました。</li>
	<li>下部の濁ったバンド( 図2Bの好中球バンド)から好中球を採取し、透明な液体の約3〜4 mL下から、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mL遠心分離チューブに収集します。好中球懸濁液を2〜3回反転させて静かに混合します。</li>
	<li>懸濁液を400 × g で20°Cで10分間遠心分離し、デカンティングして上清を慎重に除去します。</li>
	<li>ペレットを5 mLのPBSで静かに再懸濁し、300 × g で20°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>デカントして上澄み液を取り除き、真空吸引を使用してチューブ口の周りとチューブ壁に残っている上澄みを慎重に除去します。ペレットを好中球培地1mLに再懸濁します。</li>
	<li>血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。典型的には、1〜4〜10×7 個の好中球が8mLのヒト血液から得られた。 注:好中球懸濁液に赤血球汚染がある可能性があります。赤血球はほとんどのアッセイに大きな影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを妨げる可能性があります27。正確な好中球濃度を得るためには、赤血球をカウントする前に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10× PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を防ぎます。</li>
	<li>好中球培地を添加して、細胞密度を6.25×105 細胞/mLに調整します。</li>
</ol>3. 384ウェルプレートの調製
<ol><li>1.5 mLの遠心チューブに、1 mLの抗体溶液(1.2 μg/mL mAb24-APC)と0.2 mLの好中球培地を混合して、1 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の青色のウェル)のネガティブコントロールウェルに添加します。</li>
	<li>15 mLの遠心チューブ内で、9 mLの抗体溶液を21.6 μLのfMLP溶液(100 μM)および1.7784 mLの好中球培地と混合し、1 μg/mLのmAb24-APCおよび200 nM fMLPを含む溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の赤と青のウェル)のポジティブコントロールおよびテストウェルに加えます。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットを使用して、100 μM の化合物溶液のうち 5 μL を化合物ライブラリプレートから 384 ウェルプレートに移します。</li>
	<li>液体を室温で500 × gで1分間遠心分離します。 注:プレートを遠心分離するには、スイングバケットローターとプレートバケットが必要です。</li>
</ol>4. 細胞の処理
<ol><li>16チャンネルピペット(384ウェルプレートの各カラムで5〜50μLの範囲)を使用して、各ウェルに20μLの好中球懸濁液を加えます。ピペットを使用して5〜10回静かに混合し、各ピペッティング間の時間間隔を一定に保ちます。 注:ウェル内の最終濃度は次のとおりです:好中球2.5×105 細胞/ mL(すべてのウェル);mAb24-APC 0.5 μg/mL (全ウェル);fMLP 100 nM(ポジティブコントロールおよびテストウェル);化合物10μM(試験ウェル)。</li>
	<li>プレートをシェーカー上で300rpm、室温(RT)、10分間インキュベートします。</li>
	<li>16チャンネルピペット(最終PFA濃度~0.91%)を使用して、各ウェルに3 μLの16%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して細胞を固定します。その後、氷上で10分間インキュベートします。 注:好中球と PFA を添加する際には、異なるカラム間で一定の時間間隔を維持することが推奨されます。これにより、各ウェルの好中球は、fMLPおよびmAb24-APCで同じインキュベーション時間を持つようになります。</li>
</ol>5. フローサイトメトリー
<ol><li>フローサイトメーターの電源を入れ( 材料表を参照)、装置に接続されているコンピューターの電源もオンになっていることを確認します。</li>
	<li>シース液容器が満杯で、廃液容器が空で、機器に正しく接続されていることを確認してください。</li>
	<li>384ウェルプレートをフローサイトメーターのサンプルローダーにロードします。プレートの A1 ウェルがローダーの A1 マークと揃っていることを確認します。</li>
	<li>ソフトウェアを開き、新しい実験を作成します。 384ウェル を選択し、目的の蛍光色素を選択します。次に、 プレート設定をクリックし、ドラッグしてすべてのウェルを選択し、 サンプルをクリックします。「高スループット」スイッチをオンにし、レートパネルの下にある 「高」 を選択します。<ol><li>ボリュームボックスに 「50」と入力します。奇数列のサンプルを選択し、「撹拌」スイッチをアクティブにします。最後に、右側のパネルでサンプルに名前を付けます。</li>
	</ol></li>
	<li>Plot and gateをクリックします。次に、[適用]ボタン(緑色で塗りつぶされた円の上の2つの矢印)をクリックし、続いて再生ボタン(三角形の形)をクリックします。数秒待って最初のウェルからいくつかのセルを観察し、一時停止ボタンをクリックします。<ol><li>FSC 電圧と SSC 電圧を調整して、プロット上のセルが適切に可視化されるようにします。 Acquisitionをクリックし、 再生 ボタン(三角形)をクリックしてアッセイを開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメーターは、各ウェルから1000-3000の好中球を~50μL順次サンプリングします。384ウェルプレート全体を完成させるには、約3時間かかります。</li>
	<li>すべてのサンプルを完了したら、次の手順のために .fcs ファイルをエクスポートします。</li>
</ol>6. データ解析
<ol><li>フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。すべての.fcsファイルを含むフォルダを選択してソフトウェアウィンドウにドラッグし、放してデータをソフトウェアにインポートします。</li>
	<li>1つのサンプルをダブルクリックし、ポップアップウィンドウでFSCおよびSSC28、29、30 に基づくゲート単一好中球を表示します( 図3を参照)。ゲート付きの行を選択してフォルダーにドラッグし、離すと、そのフォルダー内のすべてのサンプルにゲートが適用されます。</li>
	<li>ソフトウェアのテーブルエディター機能を使用して、各ウェルからの好中球のAPC中央蛍光強度(MFI)を計算してエクスポートします。「編集」タブの「列の追加」をクリックします。統計量タブで中央値を選択し、ゲート母集団好中球を選択し、パラメータとしてAPCを選択します。[OK]ボタンをクリックします。</li>
	<li>「Table editor」タブに戻り、「Group」タブの All Samples を選択し、 Create tableボタンを押します。新しいウィンドウが開き、作成されたテーブルが表示されます。テキスト、CSV、またはExcelファイルとして保存します。</li>
	<li>エクスポートした表を開き、ポジティブコントロールサンプルとネガティブコントロールサンプルのAPC MFIの平均値と標準偏差を計算します(図4)。</li>
	<li>プレートのZ'係数(Z')は、次の式を使用して計算します。 Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn)、 ここで、σ p と σ n は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの標準偏差であり、μp と μn は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均である31。 注:Z'係数は、正の対照分布と負の対照分布の分離を示します。Z' が 0 の場合は分離がないことを意味し、Z' が 0.5 の場合は分離が等しいことを示します。以前の研究31で述べたように、Z'>0.5は化合物スクリーニングのための優れたアッセイを示しています。0.5 から 0 の範囲の Z' は許容されますが、アッセイで強いヒットを同定するだけであり、二次アッセイでさらに検証する必要があります。</li>
	<li>化合物処理した好中球のAPC MFIが、ポジティブコントロールMFIからポジティブコントロールMFIを差し引いた標準偏差の3倍より低い場合、化合物をスクリーニングの「ヒット」と見なします(P = 0.0013、 図4の点線で表されます)。</li>
</ol>

ヒト好中球におけるβ2インテグリン活性化阻害剤のスクリーニング

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言します。

好中球の刺激と染色の開始と終了は、好中球と固定剤PFAの添加によって決定されます。したがって、好中球または PFA を各カラムにピペッティングする間隔を同じにすることが重要です。これにより、各ウェルからの好中球の刺激と染色時間が一定に保たれます。好中球の寿命は短いため、ドナーからの採血からフローサイトメトリーの完了まで、すべての実験を同じ日に実施する必要があ?...

多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする1。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する必要があります2。循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります3,4。
β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの副作用は、血流中のモノクローナル抗体の循環が長引くことが原因である可能性があり、長期的には免疫機能を阻害する可能性があります8。最近の研究では、エファリズマブがαLβ2架橋とα4インテグリンの望ましくない内在化を媒介することが示されており、副作用の代替的な説明を提供しています9。したがって、短命の低分子アンタゴニストはこの問題を回避できる可能性があります。
ここでは、ヒト好中球を用いた低分子β2インテグリン拮抗薬のスクリーニングのためのハイスループット法を紹介します。β2インテグリンの活性化は、インテグリンエクトドメインへのアクセスとリガンドへの結合親和性の増加を得るために、インテグリンエクトドメインの立体配座変化を必要とします。正準スイッチブレードモデルでは、ベントクローズドインテグリンエクトドメインは、最初に拡張-閉鎖コンフォメーションまで伸長し、次にそのヘッドピースを完全に活性化された拡張-開放コンフォメーションに開きます10,11,12,13。また、ベントクローズドからベントオープン、エクステンデッドオープン、最終的には14,15,16,17,18,19までの代替経路もあります。コンフォメーション特異的抗体mAb24は、エクトドメインのヘッドピースが開いているときにヒトβ2-I様ドメインのエピトープに結合します20,21,22,23。
ここでは、mAb24-APCを使用して、β2インテグリンが活性化されているかどうかを判断します。好中球とインテグリンを活性化するために、好中球β2インテグリン24を活性化できる細菌由来の短い走化性ペプチドであるN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)をこのプロトコルの刺激として使用します。fMLPが好中球上のFpr1に結合すると、Gタンパク質、ホスホリパーゼCβ、およびホスホイノシチド3-キナーゼγを含む下流のシグナル伝達カスケードが活性化されます。これらのシグナル伝達事象は、最終的に、インサイドアウトシグナル伝達経路を介してインテグリン活性化をもたらす18,25。β2インテグリンに直接結合し、インテグリン活性化の立体構造変化を防ぐ低分子アンタゴニスト26に加えて、β2インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の成分を阻害できる化合物もこの方法で検出されます。自動フローサイトメーターにより、ハイスループットスクリーニングが可能になります。新しいアンタゴニストを同定することで、インテグリン生理学の理解が深まるだけでなく、インテグリンベースの抗炎症療法に関するトランスレーショナルな洞察が得られる可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

このプロトコルは、β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを特定する方法を確立することを目的としており、コンフォメーション変化報告抗体とハイスループットフローサイトメトリーを利用しています。この分析法は、他の抗体ベースのハイスループットスクリーニング法のガイドとしても役立ちます。β2インテグリンは、免疫応答に重要な白血球特異的な接着分子です。好中球は、感染症と戦うだけでなく、複数の炎症性疾患に関与するために、血流から出るためにインテグリンの活性化に依存しています。β2インテグリンの活性化を制御することは、好中球関連炎症性疾患を治療するための実行可能なアプローチです。このプロトコルでは、モノクローナル抗体であるmAb24は、β2インテグリンの高親和性ヘッドピースに特異的に結合し、単離された一次ヒト好中球のβ2インテグリンの活性化を定量化するために利用されます。N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)は、好中球β2インテグリンを活性化するための刺激として使用されます。この研究では、384ウェルプレートサンプルを自動的に分析できるハイスループットフローサイトメーターを使用しました。β2 インテグリン阻害に対する 320 種類の化学物質の効果を 3 時間以内に評価します。このアプローチにより、β2インテグリンを直接標的とする分子、またはGタンパク質共役受容体開始インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の標的分子を同定することができます。

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

著者スポットライト:β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを同定する方法の開発 

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

代表的な384ウェルプレートスクリーニングのデータ(図4)では、陰性対照のmAb24-APCのMFIは3236±110であり、陽性対照のmAb24-APCのMFIは7588±858であることが明らかになりました。このプレートのZ'係数は約0.33で、許容範囲内です31。ただし、Z'は二次アッセイでさらに検証する必要があります。
データを正規化するために、すべての値をス?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

本研究では好中球インテグリンに着目し、本研究ではβ-2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストの探索法の確立を目指しています。この方法により、インテグリン生理学の理解を深め、インテグリンベースの抗炎症療法へのトランスレーショナルな洞察を提供する可能性のある新しいアンタゴニストを見つけることができると信じています。今後は、新しい抗炎症薬の発見とその作用機序の解明に注力していきます。

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K ビュー.  UConn Health. 本研究では好中球インテグリンに着目し、本研究ではβ-2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストの探索法の確立を目指しています。この方法により、インテグリン生理学の理解を深め、インテグリンベースの抗炎症療法へのトランスレーショナルな洞察を提供する可能性のある新しいアンタゴニストを見つけることができると信じています。今後は、新しい抗炎症?...

ビデオ: 著者スポットライト:β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを同定する方法の開発 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.