يمنحك هذا البروتوكول نظرة عامة خطوة بخطوة حول كيفية تحضير الخرز لتنظيف التقارب وتحلل البروتين وكيفية استخدامها في تحديد البروتينات منخفضة الوفرة من العينات الدقيقة المجففة. الميزة الرئيسية هي أنه يتم إعطاؤك الأدوات اللازمة لإعداد وإجراء عينات عالية الكفاءة للعينات المعقدة من أحجام صغيرة جدا. يمكن تكييف هذه الطريقة مع المؤشرات الحيوية للبروتين الأخرى طالما كان لديك إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة الفعالة لالتقاط البروتين أو الببتيد البروتيني.
يجب أن تكون حذرا للغاية عند ضبط الرقم الهيدروجيني للمعالجة الحمضية للجسم المضاد ، خاصة إذا قمت بإعداد كمية صغيرة من الخرز. للبدء ، انقل الحجم المطلوب من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب طرد مركزي منخفض البروتين سعة خمسة ملليلتر ، وأضف قضيب تحريك مغناطيسي صغير إلى محلول الأجسام المضادة. استخدم مقياس الأس الهيدروجيني مع قطب كهربائي دقيق لقياس الأس الهيدروجيني ، واضبط الأس الهيدروجيني عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك أحادي المولي أولا ثم تقليل الحجم مع اقتراب الأس الهيدروجيني من 2.5.
سجل الحجم الكلي لحمض الهيدروكلوريك أحادي الضرس اللازم لضبط الأس الهيدروجيني على 2.5. قم بإزالة القطب الدقيق ، واحتضان الجسم المضاد المحمض على الجليد ، على محرك مغناطيسي لمدة ساعة واحدة. لمعادلة محلول الجسم المضاد، قم بقياس الأس الهيدروجيني واضبطه إلى سبعة بإضافة 10 ميكرولترات أولا من هيدروكسيد الصوديوم المولي الواحد، ثم تقليل حجم هيدروكسيد الصوديوم مع اقتراب الأس الهيدروجيني من سبعة.
سجل الحجم الكلي لهيدروكسيد الصوديوم المضاف مولار واحد. امزج تعليق الخرزة المغناطيسية جيدا على خلاط دوامة ، واسحب حجما يحتوي على الكمية المطلوبة من تعليق الخرزة. على سبيل المثال ، لإعداد ملليلتر واحد من تعليق حبة ، اسحب حجما يحتوي على 20 ملليغرام من الخرز.
ضع تعليق الخرزة على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرز مرتين بحجم متساو من الماء من النوع الأول ، واخلطه باستخدام خلاط دوامة بعد كل إضافة لمحلول الغسيل. ثم ضع المحلول مرة أخرى على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح سابقا.
أضف جسما مضادا معالجا بالحمض ، وعازلا للبورات 0.5 مولار ، وعازلا للاقتران لاقتران الأجسام المضادة بالخرز المغناطيسي. امزج باستخدام خلاط دوامة ، وقم بالتدوير في درجة الحرارة المحيطة طوال الليل باستخدام خلاط عينة من طرف إلى طرف ، ويفضل أن يكون ذلك مع الدوران المتبادل والاهتزاز. ثم ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 239 غرام.
ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة المادة الطافية. بعد غسل الخرز ، ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة ، واتبع نفس الإجراء لإزالة المادة الطافية. قم بتخزين هذا في المخزن المؤقت المطلوب باستخدام تركيز المخزون المطلوب من الخرز في الثلاجة.
اترك 10 ميكرولترات من المصل ليتم جمعها في أخذ عينات مجهرية امتصاصية حجمية سعة 10 ميكرولتر ، أو VAMS ، باستخدام إرشادات الشركة المصنعة ، وجفف في الهواء في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعتين على الأقل. قم بإزالة VAMS من الحامل ، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 2 ملليلتر. أضف 1،000 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار ، واستخرج VAMS لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية باستخدام خلاط يتم التحكم في درجة حرارته عند 1000 دورة في الدقيقة.
انقل المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي جديد منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر للتحلل البروتيني التجريبي. أضف 30 ميكرولترا من حبات التربسين المغسولة إلى كل مستخلص VAMS لبدء عملية الهضم ، واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط يتم التحكم في درجة حرارته أو ما شابه ذلك. أجهزة الطرد المركزي في 2،655 غرام لمدة خمس دقائق ، ونقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي جديد منخفض البروتين 2 ملليلتر.
أضف 25 ميكرولترا من 14 نانوجرام لكل مليلتر من المعيار الداخلي ، أو IS، محلول يحتوي على الببتيد المسمى بالنظائر المستقرة في محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مليمولار. أضف 20 ميكرولترا من معلق الخرزة المغناطيسية المغسولة إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط بالبروتين يحتوي على مستخلص VAMS المهضوم و IS. قم بإجراء الاستخراج المناعي لمدة ساعة واحدة باستخدام خلاط عينات من طرف إلى طرف في درجة الحرارة المحيطة. اغسل الخرزات المغناطيسية بإضافة 500 ميكرولتر من PBS مع 0.05٪ بوليسوربات 20.
قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق منخفض الارتباط بالبروتين الذي يحتوي على حبات ومحلول غسيل من الرف المغناطيسي ، واقلبه بعناية حتى يصبح متجانسا. بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق منخفض البروتين على المغناطيس لمدة 30 ثانية ، ثم قلبه لمدة 30 ثانية ، وضعه مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة محلول الغسيل ، وأعد غسل الخرزات المغناطيسية باستخدام PBS وحمض الهيدروكلوريك tris وبيكربونات الأمونيوم.
أضف 15 ميكرولترا من حمض الفورميك 2٪ في الماء من النوع الأول إلى كل عينة ، واحتضانها لمدة خمس دقائق عند 22 درجة مئوية و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط يتم التحكم في درجة حرارته أو ما شابه ذلك لإذابة الببتيدات الملتقطة. بعد وضع الشطف على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة ، قم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر. كرر مرة واحدة ، وانقل الشطف الثاني إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق منخفض الارتباط بالبروتين مثل الشطف الأول.
أضف 20 ميكرولترا من بيكربونات الأمونيوم 100 مليمولار إلى كل تجويف. قم بطرده ، وانقل 40 ميكرولترا من الشطف إلى إدخالات دقيقة لقوارير HPLC. في برنامج الجهاز ، اضبط درجة حرارة فرن العمود على 25 درجة مئوية ومعدل التدفق على 50 ميكرولتر في الدقيقة.
ثم ضع العينات في أخذ العينات التلقائي. قم بإعداد تسلسل يحتوي على العينات المراد تشغيلها باستخدام البرنامج المتاح لنظام LC-MS / MS ، واضبط حجم الحقن على 10 ميكرولتر. اضغط على Run Sequence في برنامج الجهاز لبدء التسلسل ، وتسجيل منطقة الذروة للببتيد التقريب الذي تم التقاطه ، والخاص ب ProGRP ، والببتيد التربتي ، و IS. يتم عرض مطياف الكتلة ، أو MS ، كروماتوجرام الببتيد البروتيني و IS بعد VAMS وبقعة المصل المجففة ، أو DSS ، أخذ العينات ، وكذلك لعينة مصل مسننة تضاف مباشرة إلى محلول الاستخراج هنا.
النتائج التمثيلية لنسبة منطقة الذروة لببتيد ProGRP البروتيني إلى IS لعينات المصل المسننة مع ProGRP وتطبيقها على VAMS أو DSS أو مباشرة على محلول الاستخراج موضحة في هذا الشكل. من هذه النتائج ، يمكن ملاحظة أن VAMS يوفر نسب مساحة مماثلة لعينة التحكم ، مما يشير إلى عدم وجود خسارة لمواد أخذ العينات ، بينما يوفر DSS نسبة مساحة أقل بكثير ، مما يشير إلى فقدان مادة أخذ العينات. يتم عرض مقارنة بين كروماتوجرام الذروة الأساسية بعد استخراج البروتين السليم واستخراج الببتيد البروتيني في هذا الشكل.
عند تحضير الأجسام المضادة أو الخرز المغلف بالإنزيم بنفسك ، يمكنك تخصيص الخرزات لتغطية احتياجاتك الخاصة. هذا مناسب لتحديد البروتين المستهدف وتحليل البروتينات العالمية. الطرق الحساسة في تحديد البروتين من VAMS وبقع الدم المجففة تجعل الأساليب الموجهة للمريض مثل الاختبار خارج المستشفى ممكنة في متابعة مجموعة واسعة من الأمراض.
