Этот протокол дает вам пошаговый обзор того, как подготовить шарики для аффинной очистки и протеолиза белка, а также как использовать их для определения белков с низким содержанием из высушенных микрообразцов. Основное преимущество заключается в том, что вам предоставляются инструменты для подготовки и выполнения высокоэффективной выборки сложных образцов из очень небольших объемов. Этот метод может быть адаптирован к другим белковым биомаркерам, если у вас есть доступ к эффективным антителам для захвата белка или протеотипического пептида.
Нужно быть очень осторожным, когда вы регулируете рН для кислотной обработки антителами, особенно если вы готовите небольшой объем шариков. Для начала перенесите желаемый объем раствора антитела в пятимиллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания белка и добавьте к раствору антитела небольшой магнитный перемешивающий стержень. Используйте рН-метр с микроэлектродом для измерения рН и отрегулируйте рН, сначала добавив 10 микролитров одномолярной соляной кислоты, а затем уменьшив объем по мере приближения рН к 2,5.
Запишите общий объем одномолярной соляной кислоты, необходимый для регулировки рН до 2,5. Извлеките микроэлектрод и инкубируйте подкисленное антитело на льду на магнитной мешалке в течение одного часа. Чтобы нейтрализовать раствор антитела, измерьте рН и отрегулируйте его до семи, сначала добавив 10 микролитров одномолярного гидроксида натрия, а затем уменьшив объем гидроксида натрия по мере приближения рН к семи.
Запишите общий объем добавленного одномолярного гидроксида натрия. Тщательно перемешайте суспензию магнитных шариков на вихревом смесителе и извлеките объем, содержащий желаемое количество суспензии шариков. Например, чтобы приготовить один миллилитр суспензии шариков, извлеките объем, содержащий 20 миллиграммов шариков.
Поместите суспензию шарика на магнитную стойку на одну минуту и удалите надосадочную жидкость. Дважды промойте шарики равным объемом воды типа I и перемешайте с помощью вихревого миксера после каждого добавления моющего раствора. Затем снова поместите раствор на магнитную стойку на одну минуту и удалите надосадочную жидкость, как показано ранее.
Добавьте обработанное кислотой антитело, 0,5-молярный боратный буфер и буфер связи для связывания антител с магнитными шариками. Смешайте с помощью вихревого смесителя и вращайте при температуре окружающей среды в течение ночи с помощью сквозного смесителя образцов, предпочтительно с взаимным вращением и вибрацией. Затем центрифугу в течение 10 минут при 239 г.
Поместите трубку на магнит на две минуты и удалите надосадочную жидкость. После промывки бусин снова поместите трубку на магнит на одну минуту и выполните ту же процедуру, чтобы удалить надосадочную жидкость. Храните его в желаемом буфере, используя желаемую концентрацию бусин в холодильнике.
Дайте собрать 10 микролитров сыворотки в 10-микролитровый объемный абсорбционный микропробоотборный наконечник или VAMS, используя рекомендации производителя, и высушите на воздухе при температуре окружающей среды не менее двух часов. Извлеките VAMS из держателя и поместите его в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания белка. Добавьте 1 000 микролитров 100-миллимолярного раствора бикарбоната аммония и извлеките VAMS в течение одного часа при 22 градусах Цельсия с помощью смесителя с регулируемой температурой при 1 000 об/мин.
Перенесите экстракт в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифугу с низким уровнем связывания белка для триптического протеолиза. Добавьте 30 микролитров промытых гранул трипсина в каждый экстракт VAMS, чтобы инициировать пищеварение, и инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия и 1000 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой или аналогичного. Центрифугу при 2 655 г в течение пяти минут и перенесите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка.
Добавьте 25 микролитров 14 нанограммов на миллилитр внутреннего стандарта, или IS, раствора, содержащего стабильный пептид, меченный изотопом, в 100-миллимолярный раствор бикарбоната аммония. Добавьте два 20 микролитра промытой суспензии магнитных шариков в каждую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка, содержащую расщепленный экстракт VAMS и IS. Выполняйте иммуноэкстракцию в течение одного часа с помощью смесителя сквозных образцов при температуре окружающей среды. Вымойте магнитные шарики, добавив 500 микролитров PBS с 0,05% полисорбатом 20.
Извлеките микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания белка, содержащую шарики и промывочный раствор, из магнитной стойки и осторожно переверните до однородной массы. Затем поместите микроцентрифугу с низким связыванием белка на магнит на 30 секунд, переверните ее на 30 секунд и снова поместите на магнит на одну минуту. Удалите моющий раствор и повторно промойте магнитные шарики PBS, соляной кислотой и бикарбонатом аммония.
Добавьте 15 микролитров 2% муравьиной кислоты в воде типа I к каждому образцу и инкубируйте в течение пяти минут при 22 градусах Цельсия и 1000 об/мин с помощью смесителя с регулируемой температурой или аналогичного для разбавления захваченных пептидов. Поместив элюат на магнит на одну минуту, перенесите его в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка. Повторите один раз и перенесите второй элюат в ту же микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка, что и первый элюат.
Добавьте 20 микролитров 100-миллимолярного бикарбоната аммония к каждому элюату. Центрифугируйте его и перенесите 40 микролитров элюата на микровкладыши для флаконов для ВЭЖХ. В программном обеспечении прибора установите температуру колонной печи на 25 градусов по Цельсию и скорость потока на 50 микролитров в минуту.
Затем поместите образцы в автосэмплер. Подготовьте последовательность, содержащую образцы для запуска с помощью программного обеспечения, доступного для системы ЖХ-МС/МС, и установите объем впрыска на 10 микролитров. Нажмите Run Sequence в программном обеспечении прибора, чтобы запустить последовательность, и запишите область пика аффинно-захваченного, ProGRP-специфического, триптического пептида и его IS. Здесь показаны масс-спектрометрия, или МС, хроматограммы протеотипического пептида и ИС после VAMS и высушенной сывороточной пятнистости, или DSS, а также для образца сыворотки с шипами, добавленного непосредственно в экстракционный раствор.
На этом рисунке показаны репрезентативные результаты отношения пиковой площади протеотипического пептида ProGRP к IS для образцов сыворотки, с добавлением ProGRP и нанесенных на VAMS, DSS или непосредственно на экстракционный раствор. Из этих результатов видно, что VAMS обеспечивает те же соотношения площадей, что и контрольный образец, что указывает на отсутствие потерь в пробоотборном материале, в то время как DSS обеспечивает значительно более низкий коэффициент площади, указывающий на потери для пробоотборного материала. На рисунке представлено сравнение хроматограмм базового пика после экстракции интактного белка и протеотипической экстракции эпитопного пептида.
Когда вы сами готовите шарики с антителами или ферментным покрытием, вы можете адаптировать бусины в соответствии с вашими конкретными потребностями. Это актуально для целевого определения белка и глобального протеомного анализа. Чувствительные методы определения белка из VAMS и высушенных пятен крови делают возможными ориентированные на пациента подходы, такие как внебольничное тестирование, при наблюдении за более широким спектром заболеваний.
