Dieses Protokoll gibt Ihnen einen Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie Sie Beads für die Affinitätsreinigung und Proteinproteolyse vorbereiten und wie Sie diese zur Bestimmung von Proteinen mit geringer Häufigkeit aus getrockneten Mikroproben verwenden können. Der Hauptvorteil besteht darin, dass Sie die Werkzeuge erhalten, um komplexe Proben aus sehr kleinen Volumina hocheffizient vorzubereiten und durchzuführen. Diese Methode kann an andere Protein-Biomarker angepasst werden, solange Sie Zugang zu effizienten Antikörpern haben, um entweder das Protein oder das proteotypische Peptid einzufangen.
Sie müssen sehr vorsichtig sein, wenn Sie den pH-Wert für die saure Behandlung des Antikörpers einstellen, insbesondere wenn Sie ein kleines Volumen an Kügelchen herstellen. Übertragen Sie zunächst das gewünschte Volumen der Antikörperlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit niedrigem Proteinbindungsvolumen von fünf Millilitern und fügen Sie der Antikörperlösung einen kleinen magnetischen Rührstab hinzu. Verwenden Sie ein pH-Messgerät mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu messen, und stellen Sie den pH-Wert ein, indem Sie zuerst 10 Mikroliter einmolare Salzsäure hinzufügen und dann das Volumen reduzieren, wenn sich der pH-Wert 2,5 nähert.
Notieren Sie das Gesamtvolumen der einmolaren Salzsäure, das erforderlich ist, um den pH-Wert auf 2,5 einzustellen. Entfernen Sie die Mikroelektrode und inkubieren Sie den angesäuerten Antikörper eine Stunde lang auf Eis auf einem Magnetrührer. Um die Antikörperlösung zu neutralisieren, messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf sieben ein, indem Sie zuerst 10 Mikroliter einmolaren Natriumhydroxid hinzufügen und dann das Volumen von Natriumhydroxid reduzieren, wenn sich der pH-Wert sieben nähert.
Notieren Sie das Gesamtvolumen des zugesetzten einmolaren Natriumhydroxids. Mischen Sie die magnetische Perlensuspension gründlich auf einem Wirbelmischer und entnehmen Sie ein Volumen, das die gewünschte Menge an Perlensuspension enthält. Um beispielsweise einen Milliliter Perlensuspension herzustellen, entnehmen Sie ein Volumen mit 20 Milligramm Perlen.
Legen Sie die Perlenaufhängung für eine Minute auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einer gleichen Menge Wasser vom Typ I und mischen Sie sie nach jeder Zugabe der Waschlösung mit einem Wirbelmischer. Legen Sie die Lösung dann erneut für eine Minute auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand wie zuvor gezeigt.
Fügen Sie säurebehandelte Antikörper, 0,5-molaren Boratpuffer und Kopplungspuffer für die Antikörperkopplung an die magnetischen Kügelchen hinzu. Mischen Sie mit einem Wirbelmischer und drehen Sie ihn über Nacht bei Umgebungstemperatur mit einem End-over-End-Probenmischer, vorzugsweise mit reziproker Rotation und Vibration. Dann 10 Minuten bei 239 g zentrifugieren.
Legen Sie das Röhrchen für zwei Minuten auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand. Legen Sie das Röhrchen nach dem Waschen der Perlen erneut für eine Minute auf den Magneten und gehen Sie wie folgt vor, um den Überstand zu entfernen. Bewahren Sie diese im gewünschten Puffer mit der gewünschten Vorratskonzentration von Perlen im Kühlschrank auf.
Lassen Sie 10 Mikroliter Serum in einer volumetrischen absorbierenden 10-Mikro-Probenahme (VAMS) gemäß den Richtlinien des Herstellers sammeln und mindestens zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur an der Luft trocknen. Nehmen Sie das VAMS aus der Halterung und legen Sie es in ein zwei Milliliter schweres, proteinarmes Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1.000 Mikroliter 100-millimolare Ammoniumbicarbonatlösung hinzu und extrahieren Sie VAMS eine Stunde lang bei 22 Grad Celsius mit einem temperaturgesteuerten Mischer bei 1.000 U / min.
Übertragen Sie den Extrakt in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung für die tryptische Proteolyse. Fügen Sie 30 Mikroliter gewaschene Trypsinkügelchen zu jedem VAMS-Extrakt hinzu, um die Verdauung einzuleiten, und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 1.000 U / min mit einem temperaturgesteuerten Mischer oder ähnlichem. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 2.655 g und überführen Sie den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.
Fügen Sie 25 Mikroliter 14 Nanogramm pro Milliliter interne Standardlösung (IS) hinzu, die das stabile isotopenmarkierte Peptid in einer 100-millimolaren Ammoniumbicarbonatlösung enthält. Geben Sie zwei 20 Mikroliter gewaschene Magnetperlensuspension in jedes proteinarme Mikrozentrifugenröhrchen, das einen verdauten VAMS-Extrakt und IS enthält. Führen Sie die Immunextraktion eine Stunde lang mit einem End-over-End-Probenmischer bei Umgebungstemperatur durch. Waschen Sie die Magnetkügelchen, indem Sie 500 Mikroliter PBS mit 0,05% Polysorbat 20 hinzufügen.
Nehmen Sie das proteinarme Mikrozentrifugenröhrchen mit Perlen und Waschlösung aus dem Magnetgestell und drehen Sie es vorsichtig um, bis es homogen ist. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung für 30 Sekunden auf den Magneten, drehen Sie es 30 Sekunden lang um und legen Sie es erneut für eine Minute auf den Magneten. Entfernen Sie die Waschlösung und waschen Sie die Magnetkügelchen erneut mit PBS, Trissalzsäure und Ammoniumbicarbonat.
Geben Sie 15 Mikroliter 2%ige Ameisensäure in Wasser vom Typ I in jede Probe und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 22 Grad Celsius und 1.000 U / min mit einem temperaturgesteuerten Mischer oder ähnlichem, um die eingefangenen Peptide zu eluieren. Nachdem Sie das Eluat eine Minute lang auf den Magneten gelegt haben, übertragen Sie es in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Wiederholen Sie den Vorgang einmal und übertragen Sie das zweite Eluat in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung wie das erste Eluat.
Fügen Sie jedem Eluat 20 Mikroliter 100-millimoläres Ammoniumbicarbonat hinzu. Zentrifugieren Sie es und geben Sie 40 Mikroliter des Eluats in Mikroeinsätze für HPLC-Fläschchen. Stellen Sie in der Gerätesoftware die Temperatur des Säulenofens auf 25 Grad Celsius und die Durchflussrate auf 50 Mikroliter pro Minute ein.
Legen Sie dann die Proben in den Autosampler. Bereiten Sie eine Sequenz vor, die die durchzuführenden Proben enthält, und stellen Sie die für das LC-MS/MS-System verfügbare Software ein, und stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 Mikroliter ein. Drücken Sie in der Gerätesoftware auf Run Sequence, um die Sequenz zu starten und die Peakfläche des affinitätserfassten, ProGRP-spezifischen, tryptischen Peptids und seines IS aufzuzeichnen. Die Massenspektrometrie oder MS-Chromatogramme des proteotypischen Peptids und des IS nach VAMS und getrocknetem Serumfleck oder DSS-Probenahme sowie für eine mit Stacheln versehene Serumprobe, die direkt in die Extraktionslösung gegeben wird, sind hier dargestellt.
Die repräsentativen Ergebnisse des Peak-Flächen-Verhältnisses des proteotypischen ProGRP-Peptids zu IS für Serumproben, die mit ProGRP versetzt und auf VAMS, DSS oder direkt auf Extraktionslösung aufgetragen wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass VAMS ähnliche Flächenverhältnisse wie die Kontrollprobe liefert, was auf keinen Verlust des Probenahmematerials hinweist, während DSS ein signifikant niedrigeres Flächenverhältnis liefert, was auf einen Verlust des Probenahmematerials hinweist. Ein Vergleich der Basenpeak-Chromatogramme nach intakter Proteinextraktion und proteotypischer Epitoppeptidextraktion ist in dieser Abbildung dargestellt.
Wenn Sie Antikörper- oder enzymbeschichtete Kügelchen selbst herstellen, können Sie die Kügelchen an Ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen. Dies ist relevant für die gezielte Proteinbestimmung und die globale Proteomik-Analyse. Empfindliche Methoden zur Proteinbestimmung aus VAMS und getrockneten Blutflecken ermöglichen patientenorientierte Ansätze wie außerklinische Tests in der Nachsorge eines breiteren Spektrums von Krankheiten.
