Este protocolo fornece uma visão geral passo a passo sobre como preparar contas para limpeza de afinidade e proteólise de proteínas e como usá-las na determinação de proteínas de baixa abundância de microamostras secas. A principal vantagem é que você recebe as ferramentas para preparar e executar amostragens altamente eficientes de amostras complexas de volumes muito pequenos. Este método pode ser adaptado a outros biomarcadores de proteína, desde que você tenha acesso a anticorpos eficientes para capturar a proteína ou o peptídeo proteotípico.
Você precisa ter muito cuidado ao ajustar o pH para o tratamento ácido do anticorpo, especialmente se você preparar pequeno volume de contas. Para começar, transfira o volume desejado de solução de anticorpos para um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros de baixa ligação a proteínas e adicione uma pequena barra de agitação magnética à solução de anticorpos. Use um medidor de pH com um microeletrodo para medir o pH e ajuste o pH adicionando primeiro 10 microlitros de ácido clorídrico monomolar e, em seguida, reduzindo o volume à medida que o pH se aproxima de 2,5.
Registrar o volume total de ácido clorídrico monomolar necessário para ajustar o pH a 2,5. Remova o microeletrodo e incube o anticorpo acidificado no gelo, em um agitador magnético por uma hora. Para neutralizar a solução de anticorpos, meça o pH e ajuste para sete, adicionando primeiro 10 microlitros de hidróxido de sódio monomolar e, em seguida, reduzindo o volume de hidróxido de sódio à medida que o pH se aproxima de sete.
Registrar o volume total de hidróxido de sódio monomolar adicionado. Misture bem a suspensão do cordão magnético em um misturador de vórtices e retire um volume contendo a quantidade desejada de suspensão de talão. Por exemplo, para preparar um mililitro de suspensão de contas, retire um volume contendo 20 miligramas de contas.
Coloque a suspensão do talão em um rack magnético por um minuto e retire o sobrenadante. Lave as contas duas vezes com um volume igual de água do tipo I e misture com um misturador de vórtices após cada adição da solução de lavagem. Em seguida, coloque a solução novamente em um rack magnético por um minuto e remova o sobrenadante como mostrado anteriormente.
Adicionar anticorpo tratado com ácido, tampão borato 0,5 molar e tampão de acoplamento para acoplamento de anticorpos às esferas magnéticas. Misture usando um misturador de vórtices e gire à temperatura ambiente durante a noite usando um misturador de amostras de ponta a ponta, de preferência com rotação e vibração recíprocas. Em seguida, centrifugar por 10 minutos a 239 g.
Coloque o tubo sobre o ímã por dois minutos e remova o sobrenadante. Depois de lavar as contas, coloque o tubo novamente no ímã por um minuto e siga o mesmo procedimento para remover o sobrenadante. Guarde-o no tampão desejado usando a concentração de estoque desejada de contas em uma geladeira.
Permitir que 10 microlitros de soro sejam coletados em uma microamostragem volumétrica absortiva de 10 microlitros, ou VAMS, usando as diretrizes do fabricante, e secar ao ar em temperatura ambiente por pelo menos duas horas. Retire o VAMS do suporte e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com baixa ligação a proteínas. Adicione 1.000 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 100 milimolares e extraia o VAMS por uma hora a 22 graus Celsius usando um misturador com temperatura controlada a 1.000 rpm.
Transfira o extrato para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas para proteólise tríptica. Adicione 30 microlitros de esferas de tripsina lavadas a cada extrato de VAMS para iniciar a digestão e incube por duas horas a 37 graus Celsius e 1.000 rpm usando um misturador com temperatura controlada ou similar. Centrifugar a 2,655 g por cinco minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros com baixo teor de proteínas.
Adicionar 25 microlitros de 14 nanogramas por mililitro de solução padrão interno, ou IS, contendo o peptídeo marcado com isótopo estável em solução de bicarbonato de amônio de 100 milimolares. Adicione dois 20 microlitros de suspensão de esferas magnéticas lavadas a cada tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas contendo um extrato VAMS digerido e IS. Realizar a imunoextração por uma hora usando um misturador de amostras de ponta a ponta à temperatura ambiente. Lave as esferas magnéticas adicionando 500 microlitros de PBS com 0,05% de polisorbato 20.
Retire o tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas que contém contas e a solução de lavagem do rack magnético e inverta cuidadosamente até ficar homogêneo. Em seguida, coloque o tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas no ímã por 30 segundos, inverta-o por 30 segundos e coloque-o novamente no ímã por um minuto. Retire a solução de lavagem e lave novamente as esferas magnéticas com PBS, ácido clorídrico tris e bicarbonato de amônio.
Adicionar 15 microlitros de ácido fórmico a 2% em água tipo I a cada amostra e incubar durante cinco minutos a 22 graus Celsius e 1.000 rpm utilizando um misturador com temperatura controlada ou similar para eluir os péptidos capturados. Depois de colocar o eluato no ímã por um minuto, transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas. Repita uma vez e transfira o segundo eluato para o mesmo tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas que o primeiro eluato.
Adicionar 20 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolares a cada eluato. Centrifugar e transferir 40 microlitros do eluato para micropastilhas para frascos de HPLC. No software do instrumento, ajuste a temperatura do forno da coluna para 25 graus Celsius e a taxa de fluxo para 50 microlitros por minuto.
Em seguida, coloque as amostras no amostrador automático. Prepare uma sequência contendo as amostras a serem executadas utilizando o software disponível para o sistema LC-MS/MS e ajuste o volume de injeção para 10 microlitros. Pressione Run Sequence no software do instrumento para iniciar a sequência e registre a área de pico do peptídeo tríptico específico do ProGRP capturado por afinidade e seu SI. Os cromatogramas por espectrometria de massa, ou MS, do peptídeo proteotípico e do SI após amostragem por VAMS e soro seco, ou DSS, bem como para uma amostra de soro fortificada adicionada diretamente na solução de extração são mostrados aqui.
Os resultados representativos da razão entre a área do pico do peptídeo proteotípico ProGRP e IS para amostras de soro fortificadas com ProGRP e aplicadas a VAMS, DSS ou diretamente à solução de extração são mostrados nesta figura. A partir desses resultados, pode-se observar que o VAMS fornece razões de área semelhantes às da amostra controle, indicando ausência de perda para o material amostral, enquanto o SAD fornece uma razão de área significativamente menor, indicando perda para o material amostral. Uma comparação dos cromatogramas de pico de base após extração de proteína intacta e extração de peptídeo epítopo proteotípico é apresentada nesta figura.
Quando você mesmo prepara contas revestidas de anticorpos ou enzimas, você pode adaptar as contas para cobrir suas necessidades específicas. Isso é relevante para determinação de proteínas direcionadas e análise proteômica global. Métodos sensíveis na determinação de proteínas a partir de VAMS e amostras de sangue em papel-filtro tornam possíveis abordagens orientadas para o paciente, como testes extra-hospitalares, no acompanhamento de uma gama mais ampla de doenças.
