ستساعد الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل والقصير أو طريقة عزل HSC الباحثين على فهم آليات تجديد الخلايا والأساس البيولوجي لعدم التجانس في حجرة HSC بشكل أفضل. تم تحديد عامل النسخ ، Hoxb5 ، والذي قد يكون علامة حصرية ل HSCs طويلة الأجل. بناء على ذلك ، تم إنشاء خط الفئران Hoxb5 وتم عزل HSCs طويلة الأجل وقصيرة الأجل بنجاح.
لبدء جمع خلايا نخاع العظم المانحة ، قم بتعقيم الهاون والمدقة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف تماما. وازن بين تلك التي تحتوي على عازل تلطيخ الخلايا يتكون من مكملات تحتوي على برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم. ضع العظام المعزولة من ذكر الفأر Hoxb5-tri-mCherry في الهاون وأضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلية.
نظف العظام بالفرشاة المفتوحة بالمدقة ، ثم قم بتفكيك كتل الخلايا عن طريق سحب لطيف ونقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. كرر العملية باستخدام محلول تلطيخ الخلايا الطازج حتى يصبح المحلول واضحا. عادة ، يكفي التكرار ثلاث مرات للتوصل إلى حل واضح.
بعد عزل عظم الفخذ والساق من الفأر المتجانس CD45.1.2 ، قم بقطع طرفي العظام بمقص معقم حاد. باستخدام إبرة قياس 23 مزودة بحقنة سعة خمسة ملليلتر مملوءة بمحلول تعليق الخلايا الباردة ، اغسل نخاع العظم في طبق مزرعة خلايا معقم يحتوي على عازل تعليق الخلية. قم بتقسيم كتل الخلايا عن طريق السحب اللطيف ، ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون باستخدام ماصة P1000.
لإعداد البوابات ، قم بإعداد العينة باتباع الإرشادات الواردة في النص ، وانقل 400 ميكرولتر منها إلى أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع مع غطاء مصفاة خلية 35 ميكرون. قم بإعداد وإضافة كاشف إجهاد الخلايا الميتة إلى العينة قبل التحليل ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وابدأ تشغيل برنامج التحليل باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ثم اضغط على تحميل لبدء الحصول على البيانات. بعد استبعاد الثنائيات والخلايا الميتة والخلايا الإيجابية للنسب ، بوابة النسب السلبية ، الكسر الإيجابي للمجموعة c ، Sca-1 الإيجابي. بعد ذلك ، قم بإخراج الكسر الموجب Flk2.
ثم بوابة Hoxb5 إيجابية أو Hoxb5 سلبية pHSCs في CD150 إيجابية ، CD34 سلبية ، أو منخفضة الكسر. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوب ربط منخفض البروتين 1.5 ملم مع 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال FBS المعطل بالحرارة بنسبة 10٪. لإجراء فرز pHSC إيجابي Hoxb5 أو Hoxb5 سلبي ، اضبط أنبوب الربط منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر على جهاز تجميع الفرز وقم بفرز pHSCs الإيجابية أو السلبية Hoxb5 في الأنبوب باستخدام استراتيجية البوابة المذكورة سابقا.
في الفرز الأول ، استخدم العائد من وضع دقة الفرز. اضبط لوحة 96 بئرا مع الخلايا الداعمة المعدة مسبقا في مرحلة وحدة ترسيب الخلايا الآلية. بعد ذلك ، اضبط أنبوب الربط منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر على منفذ التحميل لمقياس التدفق الخلوي.
قم بفرز pHSCs الإيجابية أو السلبية Hoxb5 في لوحة 96 بئرا مع الخلايا الداعمة باستخدام استراتيجية البوابة المذكورة سابقا. قم بفرز 10 pHSCs إيجابية أو سلبية Hoxb5 لاختبار قدراتها على التجديد الذاتي. كشفت مخططات قياس التدفق الخلوي لتحليل نخاع العظم للفئران المانحة Hoxb5-tri-mCherry عن ما يقرب من 20 إلى 25٪ من الخلايا في جزء pHSC المحدد بواسطة نسب سلبي ، أو إيجابي c-kit ، أو إيجابي Sca-1 ، أو إيجابي CD150 ، أو سلبي CD34 ، أو منخفض ، Flk2 سلبي كانت pHSCs إيجابية Hoxb5.
توضح هنا مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لتحليل الدم المحيطي للفئران المتلقية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الدم المحيطي للفئران المتلقية بعد الزرع الأولي أنه على الرغم من أن pHSCs الإيجابية ل Hoxb5 و Hoxb5 السلبية قدمت خيالية مماثلة للمتبرعين بعد أربعة أسابيع من الزرع ، فقد لوحظ تكون الدم المستمر في متلقي pHSC الإيجابي Hoxb5 فقط. بدأت HSCs السلبية Hoxb5 تفقد القدرة على إنتاج خلايا المكونة للدم بعد ثمانية أسابيع من الزرع.
في تحليل الزرع الثانوي ، قدم متلقو pHSC الإيجابي Hoxb5 فقط تكون الدم القوي. في المقابل ، بالكاد لوحظت خلايا مانحة في الفئران المتلقية ل Hoxb5 سلبي pHSC ، مما يشير إلى أن pHSCs السلبية Hoxb5 فقدت القدرة على التجديد الذاتي في غضون 16 أسبوعا من الزرع الأولي. يستغرق هذا البروتوكول عادة من تسع إلى 12 ساعة ، لذلك من المهم إبقاء العينة عند أربع درجات مئوية طوال الإجراءات قدر الإمكان للحفاظ على صلاحية الخلية.
