O método de isolamento de células-tronco hematopoéticas ou HSC de longo e curto prazo ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de renovação celular e a base biológica da heterogeneidade no compartimento de CTH. Um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de HSCs de longa duração, foi identificado. Com base nisso, uma linhagem de camundongos Hoxb5-repórter foi estabelecida e as HSCs de longo e curto prazo foram isoladas com sucesso.
Para iniciar a coleta das células da medula óssea do doador, esterilize uma argamassa e pilão com etanol 70% e deixe-os secar completamente. Equilibre aqueles com tampão de coloração celular composto por suplementos contendo PBS livre de cálcio e magnésio. Coloque os ossos isolados do camundongo Hoxb5-tri-mCherry macho doador na argamassa e adicione três mililitros do tampão de coloração celular.
Escove os ossos abertos com o pilão, depois desagregue os aglomerados celulares por pipetagem suave e transfira a suspensão celular através de um filtro de células de 100 mícrons para um tubo de 50 mililitros. Repita o processo com um tampão de coloração celular fresco até que a solução fique límpida. Normalmente, repetir três vezes é suficiente para produzir uma solução clara.
Depois de isolar os fêmures e tíbias do camundongo CD45.1.2 congênico, corte ambas as extremidades dos ossos com uma tesoura estéril afiada. Usando uma agulha de calibre 23 equipada com uma seringa de cinco mililitros preenchida com tampão de suspensão de células geladas, lave a medula óssea em uma placa de cultura de células estéril contendo tampão de suspensão celular. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave e, em seguida, filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons usando uma pipeta P1000.
Para a configuração do confinamento, prepare a amostra seguindo as instruções fornecidas no texto e transfira 400 microlitros dela para um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo com uma tampa de encaixe de filtro de células de 35 mícrons. Preparar e adicionar reagente de tensão de células mortas à amostra antes da análise, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, ligue o citômetro de fluxo e inicie o software de análise seguindo as instruções do fabricante.
Em seguida, pressione Carregar para começar a adquirir os dados. Após a exclusão de duplos, células mortas e células positivas para linhagem, porta a linhagem negativa, a fração positiva para c-kit, Sca-1 positiva. Em seguida, libere a fração positiva para Flk2.
Em seguida, portar pHSCs Hoxb5-positivo ou Hoxb5-negativo na fração CD150-positivo, CD34-negativo ou baixo. Em seguida, prepare um tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 milímetro com 600 microlitros de PBS livre de cálcio e magnésio, suplementado com FBS inativado pelo calor a 10%. Para realizar a classificação de pHSC Hoxb5-positivo ou Hoxb5-negativo, ajuste o tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitro preparado em um dispositivo de coleta de classificação e classifique as pHSCs Hoxb5-positivas ou Hoxb5-negativas no tubo usando a estratégia de gating mencionada anteriormente.
Na primeira classificação, use o rendimento do modo de precisão de classificação. Ajuste a placa de 96 poços com as células de suporte previamente preparadas no estágio da unidade de deposição de células automatizada. Em seguida, ajuste o tubo de ligação de 1,5 mililitro de baixa proteína para a porta de carregamento do citômetro de fluxo.
Classificar as pHSCs Hoxb5-positivas ou Hoxb5-negativas na placa de 96 poços com as células de suporte usando a estratégia de gating mencionada anteriormente. Classifique 10 pHSCs Hoxb5-positivos ou Hoxb5-negativos para testar suas capacidades de auto-renovação. Os gráficos de citometria de fluxo da análise da medula óssea dos camundongos doadores Hoxb5-tri-mCherry revelaram que aproximadamente 20 a 25% das células da fração pHSC definida por pHSCs positivas para linhagem-negativa, c-kit-positiva, Sca-1-positiva, CD150-positiva, CD34-negativa ou baixa, Flk2-negativa foram pHSCs Hoxb5-positivas.
Aqui são mostrados os gráficos representativos de citometria de fluxo da análise do sangue periférico dos camundongos receptores. Além disso, a análise do sangue periférico dos camundongos receptores após o transplante primário revelou que, embora as pHSCs Hoxb5-positivas e Hoxb5-negativas apresentassem quimerismo semelhante do doador quatro semanas após o transplante, hematopoiese contínua foi observada apenas nos receptores de pHSC Hoxb5-positivos. As HSCs Hoxb5-negativas começaram a perder a capacidade de produzir células hematopoéticas oito semanas após o transplante.
Na análise do transplante secundário, apenas os receptores de pHSC Hoxb5-positivos apresentaram hematopoese robusta. Em contraste, células doadoras foram pouco observadas nos camundongos receptores de pHSC Hoxb5-negativos, sugerindo que pHSCs Hoxb5-negativos perderam a capacidade de autorrenovação dentro de 16 semanas após o transplante primário. Esse protocolo geralmente leva de nove a 12 horas, por isso é importante manter a amostra a quatro graus Celsius durante todo o procedimento o máximo possível para manter a viabilidade celular.
