Долгосрочный и краткосрочный метод выделения гемопоэтических стволовых клеток или ГСК поможет исследователям лучше понять механизмы обновления клеток и биологические основы гетерогенности в компартменте ГСК. Был идентифицирован транскрипционный фактор Hoxb5, который может быть эксклюзивным маркером долгосрочных ГСК. На основании этого была создана линия мышей-репортеров Hoxb5, и были успешно выделены долгосрочные и краткосрочные ГСК.
Чтобы начать сбор донорских клеток костного мозга, простерилизуйте ступку и пестик 70% этанолом и дайте им полностью высохнуть. Уравновесьте те, у кого есть буфер для окрашивания клеток, состоящий из добавок, содержащих PBS, не содержащих кальция и магния. Поместите кости, выделенные от донора самца мыши Hoxb5-tri-mCherry, в ступку и добавьте три миллилитра буфера для окрашивания клеток.
Расчистите кости пестиком, затем разблокируйте клеточные комки с помощью осторожного пипетирования и перенесите клеточную суспензию через 100-микронное клеточное ситечко в 50-миллилитровую пробирку. Повторите процесс со свежим буфером для окрашивания клеток, пока раствор не станет прозрачным. Обычно достаточно повторить три раза, чтобы получить четкое решение.
После выделения бедренных и большеберцовых костей у конгенной мыши CD45.1.2 отрежьте оба конца костей острыми стерильными ножницами. Используя иглу 23-го калибра, оснащенную пятимиллилитровым шприцем, заполненным ледяным буфером клеточной суспензии, промойте костный мозг в стерильную чашку для культивирования клеток, содержащую буфер клеточной суспензии. Дезагрегируйте клеточные скопления путем осторожного пипетирования, затем отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микронное клеточное ситечко с помощью пипетки P1000.
Для установки стробирования подготовьте образец, следуя инструкциям, приведенным в тексте, и перелейте 400 микролитров из него в пробирку из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра с ячейками 35 микрон. Перед анализом подготовьте и добавьте в образец реагент, процеживающий мертвые клетки, следуя инструкциям производителя. Затем включите проточный цитометр и запустите программное обеспечение для анализа, следуя инструкциям производителя.
Затем нажмите «Загрузить», чтобы начать получение данных. После исключения дублетов, мертвых клеток и клеток, положительных по происхождению, затворите отрицательную по происхождению, c-kit-положительную, Sca-1-положительную фракцию. Затем выйдем из Flk2-положительной дроби.
Затем затворите Hoxb5-положительные или Hoxb5-отрицательные рГСК в CD150-положительную, CD34-отрицательную или низкую фракцию. Затем подготовьте 1,5-миллиметровую пробирку с низким содержанием белка с 600 микролитрами PBS без кальция и магния, дополненную 10% инактивированным теплом FBS. Чтобы выполнить Hoxb5-положительную или Hoxb5-отрицательную сортировку pHSC, установите подготовленную 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка на сортировочное устройство для сбора и отсортируйте Hoxb5-положительный или Hoxb5-отрицательный pHSC в пробирку, используя ранее упомянутую стратегию стробирования.
При первой сортировке используйте выход из режима точности сортировки. Установите 96-луночную пластину с заранее подготовленными опорными ячейками на ступень автоматизированного блока осаждения ячеек. Затем установите 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка на загрузочное отверстие проточного цитометра.
Отсортируйте Hoxb5-положительный или Hoxb5-отрицательный pHSC в 96-луночную пластину с поддерживающими ячейками, используя ранее упомянутую стратегию стробирования. Отсортируйте 10 Hoxb5-положительных или Hoxb5-отрицательных pHSC, чтобы проверить их способность к самообновлению. Графики проточной цитометрии анализа костного мозга мышей-доноров Hoxb5-tri-mCherry выявили примерно от 20 до 25% клеток во фракции pHSC, определяемой как line-negative, c-kit-положительный, Sca-1-положительный, CD150-положительный, CD34-отрицательный или низкий, Flk2-отрицательный, был Hoxb5-положительным pHSC.
Здесь показаны репрезентативные графики проточной цитометрии анализа периферической крови мышей-реципиентов. Кроме того, анализ периферической крови мышей-реципиентов после первичной трансплантации показал, что, хотя Hoxb5-положительные и Hoxb5-отрицательные рГСК проявляли сходный донорский химеризм через четыре недели после трансплантации, непрерывное кроветворение наблюдалось только у Hoxb5-положительных реципиентов рГСК. Hoxb5-отрицательные ГСК начали терять способность продуцировать гемопоэтические клетки через восемь недель после трансплантации.
В анализе вторичной трансплантации только Hoxb5-положительные реципиенты pHSC имели устойчивое кроветворение. Напротив, донорские клетки почти не наблюдались у мышей-реципиентов Hoxb5-отрицательного pHSC, что позволяет предположить, что Hoxb5-отрицательные pHSC потеряли способность к самообновлению в течение 16 недель после первичной трансплантации. Этот протокол обычно занимает от девяти до 12 часов, поэтому важно максимально поддерживать температуру образца при четырех градусах Цельсия на протяжении всех процедур, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток.
