يسمح لنا حامل الطباعة 3D المستخدم في هذا البروتوكول بمراقبة إشارات الخلايا قصيرة المدى وأحداث الهجرة الخلوية طويلة المدى في القرنيات المصابة في الوقت الفعلي. من خلال الحفاظ على الكرة الأرضية سليمة وقابلة للحياة وغير متحركة ، ينتج هذا البروتوكول صورا حية عالية الجودة لخلايا القرنية ، بما في ذلك الظهارة والأعصاب. يمكن بسهولة تعديل حامل 3D المطبوعة للكرات الأرضية من مختلف الأحجام والأنواع.
يمكننا أيضا توجيه العينين بشكل مختلف لتصوير مناطق أخرى أو إجراء تجارب المسافة البادئة النانوية. للبدء ، بعد إزالة رأس الفأر الرحيم ، ضعه على الفور على الجليد للحفاظ على صلاحية الأنسجة. ثم قم باستئصال الكرات الأرضية عن طريق تجريفها باستخدام الملقط.
وقم بقص العصب البصري باستخدام مقص التشريح أسفل المكان الذي تمسك به الملقط. احتضان الكرات الأرضية في ملليلتر من الوسط في طبق زراعة الخلايا P-35 ، بما في ذلك مؤشر الكالسيوم و / أو صبغة غشاء الخلية لمدة ساعة واحدة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع ظروف الإضاءة المنخفضة ، مما يضمن غمر الكرات الأرضية في وسط البقع لتلطيخ موحد. للصق الحوامل بغطاء سفلي زجاجي نظيف ، اغسل الحامل بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع الغراء على الحامل.
بعد ذلك ، قم بلصق الحامل بانزلاق الغطاء السفلي الزجاجي ، مما يضمن عدم وجود غراء داخل المنطقة الداخلية للحامل ، حيث يمكن أن يتألق الغراء ، مما يعقد التصوير. بعد أن يصلب الغراء ، تأكد من أن الحامل آمن ضد انزلاق الغطاء. قم بإزالة الكرات الأرضية من محلول التلوين باستخدام قطارات العين المعقمة ، مع الحرص على منع تلف الأنسجة في المنطقة محل الاهتمام.
اغسل الكرات الأرضية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات لإزالة البقع الزائدة ووضع الكرات الأرضية في الوسط لنقلها إلى المجهر. لجرح الكرات الأرضية باستخدام إبرة قياس 25 معقمة في المنطقة محل الاهتمام ، التقط الكرة الأرضية وأمسك بها من مؤخرة العين ، باستخدام قطارة معقمة للحفاظ على استقرار الكرة الأرضية ومنعها من التدحرج. بالنسبة لجرح الخدش ، حرك برفق إبرة معقمة قياس 25 عبر القرنية المكشوفة أو اضغط برفق على الإبرة مباشرة في القرنية المركزية لجرح ثقب ، مما يضمن عدم اختراق الجرح للغشاء القاعدي للقرنية.
ضع القرنية أو منطقة القزحية على زلة الغطاء في المنطقة الداخلية للحامل ، مع التأكد من وضع الكرة الأرضية بشكل صحيح وأن موقع الاهتمام ملامس لزلة الغطاء الزجاجي. استقرار باستخدام غطاء مطبوع 3D ملتصقة حامل ، وذلك باستخدام الغراء. ولا تحاول إزالة الكرة الأرضية ، لأن هذا قد يتسبب في تلف الأنسجة.
قم بتشغيل المجهر واضبط الغرفة البيئية على 35 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتحقق من الغرفة المرطبة. ضع حامل الغطاء المنزلق والكرة الأرضية المستقرة على مسرح المجهر داخل الغرفة البيئية والصورة ، باستخدام تقنيات التصوير بالخلايا الحية. عن طريق فحص وسائط نمو إضافية على زلة الغطاء لمنع الجفاف والحفاظ على صلاحية الأنسجة ، مما يضمن وجود وسيط كاف في البئر لتغطية الكرة الأرضية في الحامل.
ابدأ التجارب باستخدام تقنيات التصوير بالخلايا الحية ، مع استخدام إعدادات الليزر منخفضة الطاقة للحفاظ على الأنسجة ومنع تلف الأنسجة والأهداف المناسبة للتجارب طويلة الأمد. تسجيل وحفظ البيانات بتنسيق الملف المفضل لملفات CZI لتسجيل البيانات. تم الحصول على بيانات تصوير عالية الجودة لهيكل متعدد الطبقات للقرنية X vivo ، مثبتة بحامل مطبوع 3D ، مما يدل على أحداث إشارات الكالسيوم في الطبقات القمية والقاعدية واللحمية للقرنية.
تم الحصول على صور Z-stack للقرنية ، التي تم تجميدها في حامل 3D المطبوع ، عند جرح خدش لتصور أغشية الخلايا وإشارات الكالسيوم في جميع أنحاء طبقات القرنية وتعبئة الكالسيوم في مستويات Z المختلفة. تم إجراء تجربة سلسلة زمنية للقرنية لدراسة الهجرة الخلوية إلى سرير الجرح أثناء استجابة الشفاء ، وكشفت عن حركة صغيرة للكرة الأرضية في اتجاهات X أو Y أو Z. وقد لوحظ أنه من خلال وضع الكرة الأرضية في الحامل ، يمكن تصور مناطق مختلفة من القرنية ، سواء في المنطقة المركزية أو في منطقة القرنية القزحية.
يسمح لنا هذا البروتوكول بتصوير العيون من نماذج الأمراض التي تظهر اختلافات في التئام الجروح. يمكننا وصف الانحرافات في إشارات الخلية والحركة في الأنسجة الحية.
