このプロトコルで使用される3Dプリントホルダーにより、損傷した角膜における短期の細胞シグナル伝達と長期的な細胞移動イベントをリアルタイムで監視できます。地球を無傷で、生存可能で、動かないようにすることで、このプロトコルは上皮や神経を含む角膜細胞の高品質のライブ画像を生成します。3Dプリントされたホルダーは、さまざまなサイズや種の地球儀に合わせて簡単に変更できます。
また、他の領域を画像化したり、ナノインデント実験を行ったりするために、目の向きを変えることもできます。まず、安楽死させたマウスの頭を取り除いた後、すぐに氷の上に置いて組織の生存率を維持します。次に、ピンセットを使用して、それを居眠りさせることによって地球儀を核出します。
そして、ピンセットで保持されている場所のすぐ下で解剖ハサミを使用して視神経をクリップします。P-35細胞培養皿で2ミリリットルの培地で、カルシウムインジケーターおよび/または細胞膜染色を含む2ミリリットルの培地で、摂氏37度、5%二酸化炭素の低照度条件下でインキュベートし、均一な染色のためにグローブを染色培地に沈めます。ホルダーをきれいなガラスボトムカバースリップに取り付けるには、ホルダーを70%エタノールで洗い、接着剤をホルダーに置きます。
次に、ホルダーをガラス底カバースリップに接着し、接着剤が蛍光を発してイメージングを複雑にする可能性があるため、ホルダーの内部領域に接着剤がないことを確認します。接着剤が固まったら、ホルダーがカバースリップに対して固定されていることを確認します。滅菌スポイトを使用して染色溶液からグローブを取り除き、関心領域への組織の損傷を防ぐように注意します。
滅菌リン酸緩衝生理食塩水を使用して室温で5分間グローブを洗浄し、余分な汚れを取り除き、顕微鏡に輸送するためにグローブを培地に入れます。関心のある領域で滅菌25ゲージの針を使用してグローブを巻き取るには、滅菌スポイトを使用してグローブを目の後ろから持ち上げて保持し、グローブを安定させ、転がらないようにします。引っかき傷の場合は、露出した角膜を横切って滅菌25ゲージの針をそっと動かすか、刺し傷の場合は針を中央角膜に直接そっと押して、傷が角膜基底膜を貫通しないようにします。
角膜または辺縁部をホルダーの内側のカバースリップに置き、地球儀が正しく配置されていること、および関心のある部位がガラスカバースリップと接触していることを確認します。接着剤を使用して、ホルダーに接着された3Dプリントカバーを使用して安定させます。そして、これは組織の損傷を引き起こす可能性があるので、地球を取り除こうとしないでください。
顕微鏡の電源を入れ、環境チャンバーを摂氏35度、二酸化炭素5%に設定し、加湿チャンバーを確認します。カバースリップホルダーと安定化された地球儀を、ライブセルイメージング技術を使用して、環境チャンバー内の顕微鏡ステージに配置し、画像化します。追加の成長培地をカバースリップに吟味して脱水を防ぎ、組織の生存率を維持し、ホルダー内の地球を覆うのに十分な培地がウェルにあることを確認します。
ライブセルイメージング技術を使用して実験を開始し、低出力レーザー設定を使用して組織を保存し、組織の損傷を防ぎ、長期間の実験に適した対物レンズを使用します。データ記録用のCZIファイルの優先ファイル形式でデータを記録および保存します。3Dプリントホルダーで安定化されたX vivo角膜について、多層構造の高品質のイメージングデータが得られ、角膜の頂端層、基底層、および間質層におけるカルシウムシグナル伝達イベントが実証されました。
3Dプリントホルダーに固定された角膜のZスタック画像は、引っかき傷で取得され、角膜の層全体の細胞膜とカルシウムシグナル伝達、および異なるZ平面でのカルシウム動員を視覚化しました。治癒応答中の創傷床への細胞移動を研究するために角膜の時系列実験が行われ、X、Y、またはZ方向への地球の動きがほとんどないことが判明しました。地球儀をホルダーに配置することにより、中央および角膜辺縁領域の両方で、角膜の異なる領域を視覚化できることが観察された。
このプロトコルにより、創傷治癒に違いを示す疾患モデルから眼を画像化することができます。細胞シグナル伝達の異常と生きた組織の運動性を特徴付けることができます。
