Bu protokolde kullanılan 3D baskılı tutucu, yaralı kornealarda kısa süreli hücre sinyallemesini ve uzun süreli hücresel göç olaylarını gerçek zamanlı olarak izlememizi sağlar. Dünyayı sağlam, canlı ve hareketsiz tutarak, bu protokol epitel ve sinirler de dahil olmak üzere kornea hücrelerinin yüksek kaliteli canlı görüntülerini üretir. 3D baskılı tutucu, çeşitli boyut ve türlerdeki küreler için kolayca değiştirilebilir.
Ayrıca gözleri diğer bölgeleri görüntülemek veya nano girinti deneyleri yapmak için farklı şekilde yönlendirebiliriz. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin kafasını çıkardıktan sonra, dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra cımbız kullanarak küreleri pervane dozerleyerek enüklee edin.
Ve optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın. Küreleri, bir P-35 hücre kültürü kabında, 37 santigrat derecede bir inkübatörde bir saat boyunca bir kalsiyum göstergesi ve / veya hücre zarı boyası ve düşük ışık koşullarında% 5 karbondioksit de dahil olmak üzere ortamın iki mililitresinde inkübe ederek kürelerin düzgün boyama için leke ortamına batırılmasını sağlayın. Tutucuları temiz bir cam alt kapak kaymasına yapıştırmak için, tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın ve tutucunun üzerine yapıştırıcı yerleştirin.
Ardından, tutucuyu cam alt kapak kaymasına yapıştırın, tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir. Tutkal katılaştıktan sonra, tutucunun kapak kaymasına karşı sağlam olduğunu onaylayın. Steril damlalıkları kullanarak küreleri boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin.
Fazla lekeyi çıkarmak için steril fosfat tamponlu salin kullanarak küreleri oda sıcaklığında beş dakika yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin. İlgilenilen bölgede steril bir 25 gauge iğne kullanarak küreleri sarmak için, dünyayı sabit tutmak ve yuvarlanmasını önlemek için steril bir damlalık kullanarak dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Çizik yarası için, steril bir 25 gauge iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin veya delinme yarası için iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırarak yaranın kornea bazal membranını delmemesini sağlayın.
Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki kapak kayması üzerine yerleştirin, aynı zamanda kürenin doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen bölgenin cam kapak kaymasıyla temas halinde olduğunu onaylayın. Tutucuya yapıştırılmış 3D baskılı kapağı yapıştırıcı kullanarak stabilize edin. Ve dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.
Mikroskobu açın ve çevre odasını 35 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite ayarlayın ve nemlendirilmiş odayı doğrulayın. Kapak kayma tutucusunu ve stabilize edilmiş küreyi, canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop aşamasına yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kaymasına ek büyüme ortamını inceleyerek, kuyuda tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olmasını sağlayın.
Dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları ve uzun süreli deneyler için uygun hedefleri kullanırken canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak deneylere başlayın. Veri kaydı için CZI dosyalarının tercih edilen dosya biçiminde verileri kaydedin ve kaydedin. X vivo kornea için, korneanın apikal, bazal ve stromal tabakalarında kalsiyum sinyal olaylarını gösteren, 3D baskılı tutucu ile stabilize edilmiş çok katmanlı yapıda yüksek kaliteli görüntüleme verileri elde edildi.
3D baskılı tutucuda hareketsiz hale getirilmiş bir korneanın Z-yığını görüntüleri, kornea katmanları boyunca hücre zarlarını ve kalsiyum sinyalini ve farklı Z düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonunu görselleştirmek için bir çizik yarası elde edildi. İyileşme yanıtı sırasında yara yatağına hücresel göçü incelemek için bir korneanın zaman serisi deneyi yapıldı ve dünyanın X, Y veya Z yönlerinde çok az hareketini ortaya çıkardı. Kürenin tutucuya yerleştirilmesiyle korneanın hem merkezi hem de kornea limbal bölgesinde farklı bölgelerinin görselleştirilebileceği gözlenmiştir.
Bu protokol, yara iyileşmesinde farklılıklar gösteren hastalık modellerinden gözleri görüntülememizi sağlar. Hücre sinyalizasyonundaki anormallikleri ve canlı dokudaki hareketliliği karakterize edebiliriz.
