Der in diesem Protokoll verwendete 3D-gedruckte Halter ermöglicht es uns, kurzfristige Zellsignale und langfristige zelluläre Migrationsereignisse in verwundeten Hornhäuten in Echtzeit zu überwachen. Indem der Globus intakt, lebensfähig und unbeweglich bleibt, erzeugt dieses Protokoll qualitativ hochwertige Live-Bilder von Hornhautzellen, einschließlich Epithel und Nerven. Der 3D-gedruckte Halter konnte leicht für Globen verschiedener Größen und Arten modifiziert werden.
Wir können die Augen auch anders ausrichten, um andere Regionen abzubilden oder Nano-Indinktionsexperimente durchzuführen. Um zu beginnen, nachdem Sie den Kopf einer eingeschläferten Maus entfernt haben, legen Sie ihn sofort auf Eis, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Dann enukleieren Sie die Kugeln, indem Sie sie mit einer Pinzette einschlafen.
Und schneiden Sie den Sehnerv mit einer Dissektionsschere direkt unter der Stelle, an der er von der Pinzette gehalten wird. Inkubieren Sie die Kugeln in zwei Milliliter des Mediums in einer P-35-Zellkulturschale, einschließlich eines Kalziumindikators und / oder einer Zellmembranfärbung für eine Stunde in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei schlechten Lichtverhältnissen, um sicherzustellen, dass die Kugeln für eine gleichmäßige Färbung in das Fleckenmedium eingetaucht werden. Um die Halter an einem sauberen Glasbodendeckel zu haften, waschen Sie den Halter in 70% Ethanol und legen Sie Klebstoff auf den Halter.
Kleben Sie dann den Halter auf den Glasbodendeckel und stellen Sie sicher, dass sich kein Klebstoff im inneren Bereich des Halters befindet, da Klebstoff fluoreszieren kann, was die Bildgebung erschwert. Nachdem der Kleber erstarrt ist, vergewissern Sie sich, dass der Halter gegen den Abdeckschein gesichert ist. Entfernen Sie die Kugeln mit den sterilen Pipetten aus der Färbelösung und achten Sie darauf, Gewebeschäden in der interessierenden Region zu vermeiden.
Waschen Sie die Kugeln fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um überschüssigen Fleck zu entfernen, und legen Sie die Kugeln für den Transport zum Mikroskop in das Medium. Um die Kugeln mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel in der interessierenden Region zu wickeln, nehmen Sie die Kugel von der Rückseite des Auges auf und halten Sie sie mit einer sterilen Pipette, um die Kugel stabil zu halten und zu verhindern, dass sie rollt. Bei einer Kratzwunde bewegen Sie vorsichtig eine sterile 25-Gauge-Nadel über die freiliegende Hornhaut oder drücken Sie die Nadel vorsichtig direkt in die zentrale Hornhaut für eine Punktionswunde, um sicherzustellen, dass die Wunde nicht die Hornhaut-Basalmembran durchdringt.
Legen Sie die Hornhaut oder den limbalen Bereich auf den Deckstreifen im inneren Bereich des Halters, während Sie bestätigen, dass die Kugel korrekt positioniert ist und dass die gewünschte Stelle mit dem Glasabdeckungsglas in Kontakt steht. Stabilisieren Sie mit der 3D-gedruckten Abdeckung, die mit Klebstoff auf den Halter geklebt wird. Und versuchen Sie nicht, den Globus zu entfernen, da dies zu Gewebeschäden führen kann.
Schalten Sie das Mikroskop ein und stellen Sie die Klimakammer auf 35 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ein und überprüfen Sie die befeuchtete Kammer. Platzieren Sie den Deckelhalter und die stabilisierte Kugel auf dem Mikroskoptisch innerhalb der Klimakammer und bilden Sie mit Live-Cell-Imaging-Techniken. Durch Tierarzt zusätzliche Wachstumsmedien auf den Abdeckschlickbe, um Austrocknung zu verhindern und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, um sicherzustellen, dass genügend Medium im Brunnen vorhanden ist, um den Globus im Halter abzudecken.
Beginnen Sie Experimente mit Live-Cell-Imaging-Techniken, während Sie Lasereinstellungen mit geringer Leistung verwenden, um das Gewebe zu erhalten und Gewebeschäden zu verhindern, und geeignete Ziele für Langzeitexperimente. Zeichnen und speichern Sie Daten im bevorzugten Dateiformat von CZI-Dateien für die Datenaufzeichnung. Hochwertige Bildgebungsdaten der mehrschichtigen Struktur wurden für X-vivo-Hornhaut erhalten, die mit einem 3D-gedruckten Halter stabilisiert wurden und Kalziumsignalereignisse in den apikalen, basalen und stromalen Schichten der Hornhaut zeigten.
Z-Stack-Bilder einer Hornhaut, immobilisiert im 3D-gedruckten Halter, an einer Kratzwunde wurden erhalten, um die Zellmembranen und Kalziumsignale in den Schichten der Hornhaut und die Kalziummobilisierung in verschiedenen Z-Ebenen zu visualisieren. Ein Zeitreihenexperiment einer Hornhaut wurde durchgeführt, um die zelluläre Migration in das Wundbett während der Heilungsreaktion zu untersuchen und eine geringe Bewegung des Globus in X-, Y- oder Z-Richtung zu zeigen. Es wurde beobachtet, dass durch das Platzieren des Globus im Halter verschiedene Regionen der Hornhaut, sowohl im zentralen als auch im Hornhautlimbalbereich, sichtbar gemacht werden können.
Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Augen aus Krankheitsmodellen abzubilden, die Unterschiede in der Wundheilung aufweisen. Wir können Aberrationen in der Zellsignalisierung und Motilität in lebendem Gewebe charakterisieren.
