O suporte impresso em 3D usado neste protocolo nos permite monitorar a sinalização celular de curto prazo e os eventos de migração celular de longo prazo em córneas feridas em tempo real. Ao manter o globo intacto, viável e imóvel, este protocolo produz imagens vivas de alta qualidade das células da córnea, incluindo o epitélio e os nervos. O suporte impresso em 3D poderia ser facilmente modificado para globos de vários tamanhos e espécies.
Também podemos orientar os olhos de forma diferente para a imagem de outras regiões ou realizar experimentos de nano recuo. Para começar, depois de remover a cabeça de um rato eutanasiado, coloque-o imediatamente no gelo para preservar a viabilidade do tecido. Em seguida, enuclear os globos cochilando-o, usando pinças.
E prenda o nervo óptico usando uma tesoura de dissecção logo abaixo de onde é segurado pelas pinças. Incubar os globos em dois mililitros do meio em uma placa de cultura celular P-35, incluindo um indicador de cálcio e/ou coloração da membrana celular por uma hora em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com condições de pouca luz, garantindo que os globos estejam submersos no meio de coloração para coloração uniforme. Para aderir os suportes a uma tampa de fundo de vidro limpa, lave o suporte em etanol a 70% e coloque cola no suporte.
Em seguida, cole o suporte ao deslizamento da tampa inferior de vidro, garantindo que nenhuma cola esteja dentro da área interna do suporte, pois a cola pode fluorescer, complicando a imagem. Depois que a cola solidificar, confirme se o suporte está seguro contra o deslizamento da tampa. Retire os globos da solução de coloração usando os conta-gotas estéreis, tomando cuidado para evitar danos teciduais à região de interesse.
Lave os globos por cinco minutos à temperatura ambiente, usando solução salina tamponada com fosfato estéril para remover o excesso de mancha e colocar os globos no meio para transporte ao microscópio. Para enrolar os globos usando uma agulha estéril de calibre 25 na região de interesse, pegue e segure o globo na parte de trás do olho, usando um conta-gotas estéril para manter o globo estável e evitar que ele role. Para uma ferida de arranhão, mova suavemente uma agulha estéril de calibre 25 através da córnea exposta ou pressione suavemente a agulha diretamente na córnea central para uma ferida de punção, garantindo que a ferida não perfure a membrana basal da córnea.
Coloque a córnea ou a região limbal sobre a tampa na área interna do suporte, confirmando que o globo está posicionado corretamente e que o local de interesse está em contato com o deslizamento da tampa de vidro. Estabilize usando a tampa impressa em 3D aderida ao suporte, usando cola. E não tente remover o globo, pois isso pode causar danos nos tecidos.
Ligue o microscópio e ajuste a câmara ambiental para 35 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e verifique a câmara umidificada. Coloque o suporte de deslizamento da tampa e o globo estabilizado no estágio do microscópio dentro da câmara ambiental e da imagem, usando técnicas de imagem de células vivas. Ao examinar meios de crescimento adicionais no deslizamento da tampa para evitar a desidratação e manter a viabilidade do tecido, garantindo que haja meio suficiente no poço para cobrir o globo no suporte.
Comece experimentos usando técnicas de imagem de células vivas, enquanto usa configurações de laser de baixa potência para preservar o tecido e prevenir danos teciduais e objetivos apropriados para experimentos de longa duração. Grave e salve dados no formato de arquivo preferido de arquivos CZI para gravação de dados. Dados de imagem de alta qualidade da estrutura multicamadas foram obtidos para a córnea X vivo, estabilizada com um suporte impresso em 3D, demonstrando eventos de sinalização de cálcio nas camadas apical, basal e estromal da córnea.
Imagens de pilha Z de uma córnea, imobilizada no suporte impresso em 3D, em uma ferida de arranhão foram obtidas para visualizar as membranas celulares e a sinalização de cálcio em todas as camadas da córnea e a mobilização de cálcio em diferentes planos Z. Um experimento de série temporal de uma córnea foi realizado para estudar a migração celular para o leito da ferida durante a resposta de cicatrização, revelando pouco movimento do globo nas direções X, Y ou Z. Observou-se que, ao colocar o globo no titular, diferentes regiões da córnea, tanto na região central quanto na região límbica da córnea, podem ser visualizadas.
Este protocolo nos permite visualizar os olhos de modelos de doenças que exibem diferenças na cicatrização de feridas. Podemos caracterizar aberrações na sinalização celular e motilidade em tecido vivo.
