Le support imprimé en 3D utilisé dans ce protocole nous permet de surveiller en temps réel la signalisation cellulaire à court terme et les événements de migration cellulaire à long terme dans les cornées blessées. En gardant le globe intact, viable et immobile, ce protocole produit des images en direct de haute qualité des cellules cornéennes, y compris l’épithélium et les nerfs. Le support imprimé en 3D pourrait facilement être modifié pour des globes de différentes tailles et espèces.
Nous pouvons également orienter les yeux différemment pour imager d’autres régions ou effectuer des expériences de nano-indention. Pour commencer, après avoir retiré la tête d’une souris euthanasiée, placez-la immédiatement sur de la glace pour préserver la viabilité du tissu. Ensuite, énucléez les globes en les assoupissant à l’aide d’une pince à épiler.
Et coupez le nerf optique à l’aide de ciseaux à dissection juste en dessous de l’endroit où il est maintenu par la pince à épiler. Incuber les globes dans deux millilitres du milieu dans une boîte de culture cellulaire P-35, y compris un indicateur de calcium et / ou une coloration de membrane cellulaire pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans des conditions de faible luminosité, en veillant à ce que les globes soient immergés dans le milieu de coloration pour une coloration uniforme. Pour coller les supports à un couvercle inférieur en verre propre, lavez le support avec de l’éthanol à 70% et placez de la colle sur le support.
Ensuite, collez le support au couvercle inférieur en verre, en veillant à ce qu’aucune colle ne se trouve dans la zone interne du support, car la colle peut devenir fluorescente, ce qui complique l’imagerie. Une fois la colle solidifiée, vérifiez que le support est bien fixé contre le couvercle. Retirez les globes de la solution de coloration à l’aide des pipettes oculaires stériles, en prenant soin d’éviter d’endommager les tissus de la région d’intérêt.
Lavez les globes pendant cinq minutes à température ambiante, en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile pour enlever l’excès de tache et placez les globes dans le milieu pour le transport au microscope. Pour enrouler les globes à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25 dans la région d’intérêt, ramassez et tenez le globe à l’arrière de l’œil, en utilisant un compte-gouttes stérile pour maintenir le globe stable et l’empêcher de rouler. Pour une plaie d’égratignure, déplacez doucement une aiguille stérile de calibre 25 sur la cornée exposée ou appuyez doucement sur l’aiguille directement dans la cornée centrale pour une plaie perforante, en veillant à ce que la plaie ne perce pas la membrane basale cornéenne.
Placez la cornée ou la région limbique sur le couvercle dans la zone interne du support, tout en confirmant que le globe est correctement positionné et que le site d’intérêt est en contact avec le couvercle en verre. Stabiliser à l’aide du couvercle imprimé en 3D collé au support, à l’aide de colle. Et n’essayez pas d’enlever le globe, car cela pourrait causer des dommages aux tissus.
Allumez le microscope et réglez la chambre environnementale à 35 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et vérifiez la chambre humidifiée. Placez le support de glissière et le globe stabilisé sur la platine du microscope dans la chambre environnementale et l’image, en utilisant des techniques d’imagerie de cellules vivantes. En examinant le milieu de croissance supplémentaire sur la lamelle de couverture pour prévenir la déshydratation et maintenir la viabilité des tissus, en veillant à ce qu’il y ait suffisamment de milieu dans le puits pour couvrir le globe dans le support.
Commencez des expériences en utilisant des techniques d’imagerie de cellules vivantes, tout en utilisant des réglages laser de faible puissance pour préserver le tissu et prévenir les dommages tissulaires et des objectifs appropriés pour les expériences de longue durée. Enregistrez et sauvegardez les données dans le format de fichier préféré des fichiers CZI pour l’enregistrement des données. Des données d’imagerie de haute qualité de la structure multicouche ont été obtenues pour la cornée X vivo, stabilisée avec un support imprimé en 3D, démontrant des événements de signalisation du calcium dans les couches apicale, basale et stromale de la cornée.
Des images Z-stack d’une cornée, immobilisée dans le support imprimé en 3D, sur une plaie scratch ont été obtenues pour visualiser les membranes cellulaires et la signalisation du calcium à travers les couches de la cornée et la mobilisation du calcium dans différents plans Z. Une expérience de série chronologique d’une cornée a été réalisée pour étudier la migration cellulaire dans le lit de la plaie pendant la réponse de guérison, révélant peu de mouvement du globe dans les directions X, Y ou Z. Il a été observé qu’en plaçant le globe dans le support, différentes régions de la cornée, à la fois au centre et dans la région limbique cornéenne peuvent être visualisées.
Ce protocole nous permet d’imager les yeux à partir de modèles de maladies qui présentent des différences dans la cicatrisation des plaies. Nous pouvons caractériser les aberrations dans la signalisation cellulaire et la motilité dans les tissus vivants.
