使用新型3D打印支架对完整的 离体 地球仪进行活细胞成像

该协议中使用的3D打印支架使我们能够实时监测受伤角膜中的短期细胞信号传导和长期细胞迁移事件。通过保持眼球完整、可行和不动，该协议产生高质量的角膜细胞实时图像，包括上皮和神经。3D打印支架可以很容易地修改为各种尺寸和物种的地球仪。

我们还可以以不同的方式定位眼睛以成像其他区域或进行纳米压痕实验。首先，在取出安乐死小鼠的头部后，立即将其放在冰上以保持组织的活力。然后用镊子通过道具打瞌睡来去除地球仪。

并用解剖剪刀夹住视神经，就在镊子固定视神经的下方。在P-35细胞培养皿中将球体在两毫升培养基中孵育，包括钙指示剂和/或细胞膜染色剂在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中在低光照条件下孵育一小时，确保将球浸没在染色培养基中以进行均匀染色。要将支架粘附在干净的玻璃底盖上，请在 70% 乙醇中清洗支架并将胶水涂在支架上。

然后，将支架粘附在玻璃底盖上，确保支架内部区域内没有胶水，因为胶水会发出荧光，使成像复杂化。胶水凝固后，确认支架与盖玻片牢固。使用无菌滴管从染色溶液中取出地球仪，注意防止组织对感兴趣区域造成损害。

在室温下洗涤地球仪五分钟，使用无菌磷酸盐缓冲盐水去除多余的污渍，并将地球仪放入培养基中以运输到显微镜。要在感兴趣的区域使用无菌 25 号针头缠绕地球仪，请使用无菌吸管从眼睛后部拿起并握住地球仪，以保持眼球稳定并防止其滚动。对于划痕伤口，轻轻移动无菌 25 号针穿过暴露的角膜，或将针头直接轻轻按入中央角膜以进行穿刺伤口，确保伤口不会刺穿角膜基底膜。

将角膜或角膜缘区域放在支架内部区域的盖玻片上，同时确认地球仪位置正确且感兴趣部位与玻璃盖玻片接触。使用粘附在支架上的 3D 打印盖子，使用胶水稳定。并且不要试图取下地球仪，因为这可能会导致组织损伤。

打开显微镜，将环境室设置为35摄氏度和5%二氧化碳，并验证加湿室。使用活细胞成像技术将盖玻片支架和稳定地球仪放在环境室内的显微镜载物台上并成像。通过在盖玻片上检查额外的生长培养基以防止脱水并保持组织活力，确保孔中有足够的培养基覆盖支架中的球体。

使用活细胞成像技术开始实验，同时使用低功率激光设置来保存组织并防止组织损伤和适合长时间实验的目标。以CZI文件的首选文件格式记录和保存数据以进行数据记录。通过3D打印支架稳定，获得了X体内角膜多层结构的高质量成像数据，展示了角膜顶端，基底和基质层中的钙信号事件。

获得角膜的Z-stack图像，固定在3D打印支架中，在划痕伤口处，以可视化整个角膜层的细胞膜和钙信号传导以及不同Z平面中的钙动员。进行了角膜的时间序列实验，以研究愈合反应期间细胞迁移到伤口床中的情况，揭示了眼球在X，Y或Z方向上的运动很小。据观察，通过将地球仪放在支架中，可以可视化角膜的不同区域，包括中央和角膜边缘区域。

该协议使我们能够从表现出伤口愈合差异的疾病模型中对眼睛进行成像。我们可以表征活组织中细胞信号传导和运动中的畸变。