يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية للقولون في بيئة قابلة للتلاعب بتكلفة أقل في الوقت المناسب من النماذج الحيوانية. تسمح الثقافة العضوية بدراسة وظيفة الخلايا الجذعية في بيئة خالية من المناعة. هذا يسمح بتحديد آثار سبب معين ، مثل خروج المغلوب من claudin-7.
إن فهم آليات وظيفة الخلايا الجذعية قد يلقي الضوء على أهداف علاجية جديدة للأمراض الموهنة مثل مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون والمستقيم. لبدء عزل خبايا القولون من الفأر الرحيم ، قم بعمل شق بوصتين تقريبا أسفل خط الوسط للماوس. ثم ، دبوس الجلد مرة أخرى لكشف البطن.
قطع القولون أسفل coecum مباشرة من الجانب القريب وفوق المستقيم من الجانب البعيد لعزل القولون. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية المرفقة بالقولون باستخدام ملقط. بعد دفع البراز من القولون المعزول مع الطرف المسطح للملقط ، قم بقطع الأنسجة مفتوحة طوليا.
اغسل المنديل من 10 إلى 15 مرة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد عن طريق تحريك المنديل في برنامج تلفزيوني بين الغسلات بالملقط. ثم باستخدام زوج من المقصات النظيفة والحادة ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة تتراوح من حوالي ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. بعد عزل القولون عن فأر آخر تم قتله رحيما ، ادمج جميع قطع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يحتوي على وسائط تفكك ظهاري باردة واحتضان قطع أنسجة القولون في وسائط تفكك ظهاري لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف.
بعد الحضانة ، اسمح لشظايا الأنسجة بالغرق في قاع الأنبوب. بمجرد الاستقرار ، تخلص من وسائط التفكك الظهاري دون تعطيل شظايا الأنسجة. كرر العملية عند غسل الأنسجة من 10 إلى 15 مرة باستخدام PBS البارد.
تخلص من أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني أثناء الغسيل النهائي. بعد ذلك ، أضف وسائط تفكك القبو البارد إلى قطع أنسجة القولون المغسولة في أنبوب سعة 50 ملليلتر ورجها لمدة خمس إلى 10 دقائق باليد. تحت غطاء زراعة الخلايا ، قم بتصفية الوسائط التي تحتوي على الأنسجة باستخدام مصفاة خلية نايلون 70 ميكرون في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.
بعد الترشيح ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالتخلص من المادة الطافية دون إزعاج الخبايا المحببة. أعد تعليق الحبيبات في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من PBS البارد. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق سرداب في خط على شريحة المجهر.
باستخدام المجهر ، احسب عدد الخبايا الطويلة الكاملة لتقدير تركيز القبو وحساب الحجم المناسب للأقبية المطلوبة للوحة 10 أقبية لكل ميكرولتر في لوحة 96 بئرا. الطرد المركزي حجم مناسب من الخبايا المعزولة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر دون تعطيل الخبايا المحببة.
ثم أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة الهلام إلى الخبايا المحببة دون إدخال فقاعات هواء. انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى تصلب مصفوفة الهلام جزئيا. بعد ذلك ، يتم خلط لوحة 10 ميكرولتر من مصفوفة الهلام مع الخبايا في كل بئر من لوحة استزراع 96 بئرا تم تسخينها مسبقا لتشكيل شكل قبة.
اترك من 10 إلى 20 دقيقة حتى يتم ضبط مصفوفة الجل بالكامل عن طريق وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل الطازج لوسائط L-WRN المكملة بالمضادات الحيوية إلى كل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لحصاد المواد العضوية ، قم بإزالة الوسائط القديمة من الآبار عن طريق تطبيق شفط فراغي وإصلاح المواد العضوية بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم قم بإزالة 4٪ بارافورمالدهيد من الآبار عن طريق الشفط الفراغي ومعالجة المواد العضوية ب 100 ميكرولتر من 30٪ سكروز لكل بئر عند أربع درجات مئوية. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة 30٪ سكروز من الآبار عن طريق الشفط الفراغي قبل إضافة 10 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر. استخدم طرف ماصة لخدش قاع البئر برفق لفصل المواد العضوية المحتوية على القبة.
بعد ذلك ، قم بإزالة PBS الذي يحتوي على المواد العضوية المنفصلة من البئر باستخدام ماصة وانقله إلى قالب بلاستيكي مسمى مملوء بنسبة 90٪ بدرجة حرارة القطع المثلى ، أو مركب OCT. استمر في العملية حتى تتم إزالة جميع المواد العضوية من جميع الآبار. أضف 2-ميثيل بوتان إلى قارورة ديوار المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ والتي تحتوي على كريات ثلج جافة, بما يكفي لتغطية الكريات.
قم بتجميد العضو العضوي الذي يحتوي على كتلة OCT عن طريق تثبيته بثبات فوق 2-methylbutane. أخيرا ، قم بتخزين كتلة OCT المحتوية على عضوي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتقسيم. تسلط الصورة التمثيلية الضوء على النمو الناجح للقولونات من الخبايا العادية التي تحتوي على claudin-7.
بدأت الخبايا التي تحتوي على claudin-7 في تكوين كرويات بحلول اليوم الثاني ، وبدأت في التبرعم في اليوم الخامس ، واستمرت في النمو والتبرعم حتى تم حصادها في اليوم التاسع. في المقابل ، فشلت الخبايا التي تفتقر إلى claudin-7 في تكوين القولون المناسب. بعد العلاج ب 4-هيدروكسيتاموكسيفين لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، ظهرت خبايا كلاودين -7 بالضربة القاضية ككتل دائرية من الخلايا.
على عكس عنصر التحكم ، لم تنمو الخبايا لتصبح كرويات صحية. أكد تلطيخ التألق المناعي للكلاودين -7 في السيطرة المحصودة وعضويات الضربة القاضية الشرطية نجاح خروج المغلوب من claudin-7 في الثقافة. أظهرت القولونات الضابطة إشارة موت الخلايا المبرمج قليلة جدا في اليوم التاسع.
ومع ذلك ، أظهر القولون بالضربة القاضية claudin-7 موت الخلايا المبرمج العالي في نفس الوقت. ضمان التصلب الجزئي قبل الطلاء. سيؤدي الطلاء قبل التصلب الجزئي إلى انتشار مصفوفة الهلام ولن تتشكل القبة ، مما يؤثر على بقاء ونمو الخبايا.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لاكتشاف الأدوية ، ودراسة الاتصالات الخلوية ، واستقلاب الدواء ، وصلاحيته ، وانتشاره ، وتطوير علاج شخصي خاص بالمريض. أحدث إنشاء ثقافة عضوية ثورة في دراسة الأمراض والطب الشخصي.
