Bu protokol, kolon kök hücrelerinin işlevini, hayvan modellerinden daha düşük maliyetle manipüle edilebilir bir ortamda incelemek için bir yöntem sağlar. Organoid kültür, bağışıksız bir ortamda kök hücre fonksiyonunun incelenmesine izin verir. Bu, claudin-7'nin nakavtı gibi belirli bir nedenin etkilerini belirlemeye izin verir.
Kök hücre fonksiyonunun mekanizmalarını anlamak, inflamatuar bağırsak hastalığı ve kolorektal kanser gibi zayıflatıcı hastalıklar için yeni terapötik hedeflere ışık tutabilir. Kolonik kriptlerin ötenazi fareden izole edilmesine başlamak için, farenin orta çizgisinden yaklaşık iki inçlik bir kesi yapın. Ardından, karnı açığa çıkarmak için cildi geri sabitleyin.
Kolonu izole etmek için kolonu proksimal taraftan koecumun hemen altından ve rektumun üstünden distal taraftan kesin. Daha sonra, forseps kullanarak kolona bağlı yağ dokusunu çıkarın. Forsepslerin düz ucu ile izole kolondan dışkıyı dışarı ittikten sonra, dokuyu uzunlamasına açın.
Forsepsli yıkamalar arasında dokuyu PBS'de döndürerek dokuyu soğuk PBS ile 10 ila 15 kez yıkayın. Daha sonra bir çift temiz, keskin makas kullanarak, dokuyu yaklaşık üç ila beş milimetre arasında değişen küçük parçalara ayırın. Kolonu başka bir ötenazi fareden izole ettikten sonra, tüm doku parçalarını soğuk epitel ayrışma ortamı içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde birleştirin ve kolon dokusu parçalarını epitel ayrışma ortamında 90 dakika boyunca dört santigrat derecede yumuşak sallanma ile inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, doku parçalarının tüpün dibine batmasına izin verin. Yerleştikten sonra, doku parçalarını bozmadan epitel ayrışma ortamını atın. Dokuyu soğuk PBS ile 10 ila 15 kez yıkarken işlemi tekrarlayın.
Son yıkama sırasında mümkün olduğunca fazla PBS atın. Daha sonra, 50 mililitrelik bir tüpte yıkanmış kolon dokusu parçalarına soğuk kript ayrışma ortamı ekleyin ve elle beş ila 10 dakika çalkalayın. Hücre kültürü başlığının altında, dokuyu içeren medyayı 70 mikronluk naylon hücre süzgeci ile taze 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
Filtrelemeden sonra, tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj edin, ardından peletlenmiş kriptleri rahatsız etmeden süpernatantı atın. Peleti üç ila dört mililitre soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Pipet 10 mikrolitrelik kript süspansiyonu mikroskop üzerindeki bir çizgi halinde kaydırır.
Mikroskobu kullanarak, kript konsantrasyonunu tahmin etmek için tam, uzun kriptlerin sayısını sayın ve 96 delikli bir plakada mikrolitre başına 10 kript plakalamak için gereken uygun kript hacmini hesaplayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 G'de 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde uygun miktarda izole edilmiş kriptleri santrifüj edin. Ardından, pelet edilmiş kriptleri bozmadan 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.
Daha sonra, hava kabarcıkları sokmadan peletlenmiş kriptlere 100 mikrolitre jel matrisi ekleyin. Jel matrisi kısmen katılaşana kadar bir ila iki dakika bekleyin. Daha sonra, jel matrisinin 10 mikrolitrelik plakası, bir kubbe şekli oluşturmak için önceden ısıtılmış 96 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğundaki kriptlerle karıştırılır.
Jel matrisinin, plakayı% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirerek tam olarak ayarlanması için 10 ila 20 dakika bekleyin. Son olarak, her bir oyuğa antibiyotiklerle desteklenmiş taze hazırlanmış L-WRN ortamının çalışma çözeltisinden 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Organoidleri hasat etmek için, vakum emiş uygulayarak eski ortamları kuyucuklardan çıkarın ve organoidleri oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
Daha sonra vakum emme ile kuyulardan% 4 paraformaldehit çıkarın ve organoidleri dört santigrat derecede kuyucuk başına 100 mikrolitre% 30 sakkaroz ile tedavi edin. 24 saat sonra, her bir kuyucuğa 10 mikrolitre PBS eklemeden önce vakum emme ile kuyulardan% 30 sakkaroz alın. Kubbe içeren organoidleri ayırmak üzere kuyucuğun tabanını nazikçe çizmek için bir pipet ucu kullanın.
Daha sonra, ayrışmış organoidleri içeren PBS'yi kuyudan bir pipetle çıkarın ve% 90'ı optimum kesme sıcaklığı veya OCT, bileşiği ile doldurulmuş etiketli bir plastik kalıba aktarın. Tüm organoidler tüm kuyucuklardan çıkarılana kadar işleme devam edin. Peletleri örtmeye yetecek kadar kuru buz topakları içeren paslanmaz çelik bir Dewar şişesine 2-metilbütan ekleyin.
OCT bloğu içeren organoidi, 2-metilbütan üzerinde sabit bir şekilde tutarak flaşla dondurun. Son olarak, organoid içeren OCT bloğunu kesitlenmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Temsili görüntü, claudin-7 içeren normal kriptlerden kolonoidlerin başarılı büyümesini vurgulamaktadır.
Claudin-7 içeren kriptler ikinci günde sferoidler oluşturmaya başladı, beşinci günde tomurcuklanmaya başladı ve dokuzuncu günde hasat edilene kadar büyümeye ve tomurcuklanmaya devam etti. Buna karşılık, claudin-7'den yoksun kriptler uygun kolonoidler oluşturamadı. İki ila üç gün boyunca 4-hidroksitamoksifen ile tedaviden sonra, claudin-7 nakavt kriptleri dairesel hücre kümeleri olarak ortaya çıktı.
Kontrolün aksine, kriptler sağlıklı sferoidlere dönüşmedi. Hasat edilen kontrolde claudin-7 için immünofloresan boyama ve koşullu nakavt organoidleri, kültürde claudin-7'nin başarılı bir şekilde nakavt edildiğini doğruladı. Kontrol kolonoidleri dokuzuncu günde çok az apoptotik sinyal sergiledi.
Bununla birlikte, claudin-7 nakavt kolonoidleri aynı zamanda yüksek apoptoz gösterdi. Kaplamadan önce kısmi katılaşma sağlayın. Kısmi katılaşmadan önce kaplama, jel matrisinin yayılmasına ve kubbenin oluşmasına neden olacak ve kriptlerin hayatta kalmasını ve büyümesini etkileyecektir.
Bu protokol, ilaç keşfi, hücresel iletişim, ilaç metabolizması, canlılık, proliferasyon ve hastaya özgü kişiselleştirilmiş tedavi geliştirme için kullanılabilir. Organoid kültürün kurulması, hastalıkların ve kişiselleştirilmiş tıbbın incelenmesinde devrim yarattı.
