이 프로토콜은 동물 모델보다 시간이 적게 소요되는 조작 가능한 환경에서 결장 줄기 세포의 기능을 연구하는 방법을 제공합니다. 오가노이드 배양을 통해 면역이 없는 환경에서 줄기세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이를 통해 claudin-7의 녹아웃과 같은 특정 원인의 영향을 정확히 찾아낼 수 있습니다.
줄기 세포 기능의 메커니즘을 이해하면 염증성 장 질환 및 대장 암과 같은 쇠약 질환에 대한 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있습니다. 안락사 된 마우스에서 결장 음와를 분리하기 시작하려면 마우스의 정중선 아래로 약 2 인치의 절개를하십시오. 그런 다음 피부를 다시 고정하여 복부를 노출시킵니다.
결장을 분리하기 위해 근위부에서 코쿰 바로 아래, 원위부에서 직장 위의 결장을 자릅니다. 다음으로 집게를 사용하여 결장에 부착 된 지방 조직을 제거하십시오. 집게의 평평한 끝으로 격리 된 결장에서 대변을 밀어 낸 후 조직을 세로로 자릅니다.
집게로 씻는 사이에 PBS에서 조직을 소용돌이 치면서 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 씻으십시오. 그런 다음 깨끗하고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 약 3-5 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 안락사된 다른 마우스로부터 결장을 분리한 후, 차가운 상피 해리 배지가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 모든 조직 조각을 결합하고 결장 조직 조각을 상피 해리 배지에서 섭씨 4도에서 90분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다.
배양 후 조직 조각이 튜브 바닥으로 가라 앉도록하십시오. 일단 침전되면 조직 조각을 방해하지 않고 상피 해리 배지를 폐기하십시오. 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 세척 할 때이 과정을 반복하십시오.
최종 세척 중에 가능한 한 많은 PBS를 폐기하십시오. 다음으로, 50 밀리리터 튜브에서 씻은 결장 조직 조각에 차가운 지하실 해리 배지를 넣고 손으로 5-10 분 동안 흔 듭니다. 세포 배양 후드 아래에서 70미크론 나일론 세포 여과기로 조직이 포함된 배지를 신선한 50밀리리터 원심분리 튜브에 여과합니다.
여과 후, 실온에서 10분 동안 200G에서 튜브를 원심분리한 다음, 펠렛화된 음와를 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 펠릿을 3-4 밀리리터의 차가운 PBS에 다시 현탁시킵니다. 현미경 슬라이드의 한 줄에 10 마이크로 리터의 지하실 현탁액을 피펫팅합니다.
현미경을 사용하여 완전하고 긴 음굴의 수를 계산하여 음핵 농도를 추정하고 96웰 플레이트에 마이크로리터당 10개의 음굴을 도금하는 데 필요한 적절한 음굴 부피를 계산합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200G의 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에 적절한 양의 분리된 음와를 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿화된 음와를 방해하지 않고 1, 000마이크로리터 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다.
그런 다음 기포를 도입하지 않고 펠릿화된 지하실에 100마이크로리터의 겔 매트릭스를 추가합니다. 겔 매트릭스가 부분적으로 응고 될 때까지 1-2 분 동안 기다리십시오. 이어서, 예열된 96-웰 배양 플레이트의 각 웰 내의 토굴과 혼합된 겔 매트릭스의 10 마이크로리터를 플레이트하여 돔 형상을 형성하였다.
5% 이산화탄소 하에서 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 넣어 겔 매트릭스가 완전히 굳을 때까지 10-20분 동안 기다립니다. 마지막으로, 항생제가 보충 된 L-WRN 배지의 새로 준비된 작업 용액 100 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 하에서 24 시간 동안 배양합니다. 오가노이드를 수확하려면 진공 흡입을 적용하여 웰에서 오래된 배지를 제거하고 실온에서 1시간 동안 4%파라포름알데히드로 오가노이드를 고정합니다.
그런 다음 진공 흡입으로 웰에서 4% 파라포름알데히드를 제거하고 섭씨 4도에서 웰당 100마이크로리터의 30% 자당으로 오가노이드를 처리합니다. 24시간 후, 각 웰에 10마이크로리터의 PBS를 추가하기 전에 진공 흡입으로 웰에서 30% 자당을 제거합니다. 피펫 팁을 사용하여 우물 바닥을 부드럽게 긁어 돔 함유 유기체를 해리하십시오.
다음으로, 피펫으로 웰에서 해리된 오가노이드가 포함된 PBS를 제거하고 최적의 절단 온도 또는 OCT 화합물로 90%로 채워진 라벨이 붙은 플라스틱 몰드로 옮깁니다. 모든 웰에서 모든 유기체가 제거 될 때까지 과정을 계속하십시오. 펠릿을 덮기에 충분한 드라이 아이스 펠릿이 들어있는 스테인레스 스틸 Dewar 플라스크에 2- 메틸 부탄을 첨가하십시오.
OCT 블록을 함유하는 오가노이드를 2-메틸부탄 위에 꾸준히 유지하여 급속 동결시킨다. 마지막으로, 절단할 준비가 될 때까지 오가노이드 함유 OCT 블록을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 대표 이미지는 claudin-7을 함유 한 정상 음와에서 콜로노이드의 성공적인 성장을 강조합니다.
claudin-7을 포함하는 지하실은 둘째 날부터 스페로이드를 형성하기 시작했고, 5일째에 싹이 트기 시작했으며, 9일째에 수확될 때까지 계속 성장하고 싹이 트었습니다. 대조적으로, claudin-7이 부족한 음와에서는 적절한 콜로노이드를 형성하지 못했습니다. 2-3 일 동안 4- 하이드 록시 타목시펜으로 치료 한 후, claudin-7 녹아웃 토굴은 원형 세포 덩어리로 나타났습니다.
대조군과 달리 지하실은 건강한 스페로이드로 자라지 않았습니다. 수확된 대조군에서 클로딘-7에 대한 면역형광 염색 및 조건부 녹아웃 오가노이드는 배양에서 클라우딘-7의 성공적인 녹아웃을 확인하였다. 대조군 콜로노이드는 9일째에 매우 적은 세포사멸 신호를 나타내었다.
그러나 claudin-7 녹아웃 콜로노이드는 동시에 높은 세포 사멸을 나타 냈습니다. 도금하기 전에 부분 응고를 확인하십시오. 부분 응고 전에 도금하면 겔 매트릭스가 퍼지고 돔이 형성되지 않아 지하실의 생존과 성장에 영향을 미칩니다.
이 프로토콜은 약물 발견, 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 환자 맞춤형 개인화 치료 개발에 활용될 수 있습니다. 오가노이드 배양의 확립은 질병 및 개인화 된 의학 연구에 혁명을 일으켰습니다.
