Этот протокол предоставляет метод изучения функции стволовых клеток толстой кишки в манипулируемой среде с меньшими затратами во времени, чем животные модели. Органоидная культура позволяет изучать функцию стволовых клеток в безиммунной среде. Это позволяет точно определить последствия конкретной причины, такой как нокаут клодина-7.
Понимание механизмов функции стволовых клеток может пролить свет на новые терапевтические цели для изнурительных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак. Чтобы начать изоляцию толстых склепов от усыпленной мыши, сделайте разрез примерно на два дюйма ниже средней линии мыши. Затем зажмите кожу обратно, чтобы обнажить живот.
Отрежьте толстую кишку чуть ниже половой оболочки с проксимальной стороны и над прямой кишкой с дистальной стороны, чтобы изолировать толстую кишку. Далее удаляют жировую ткань, прикрепленную к толстой кишке с помощью щипцов. После выталкивания кала из изолированной толстой кишки плоским концом щипцов разрезают ткань, открытую продольно.
Промыть ткань от 10 до 15 раз холодным PBS, закручивая ткань вокруг PBS между стиражами щипцами. Затем, используя пару чистых, острых ножниц, разрежьте ткань на мелкие кусочки размером примерно от трех до пяти миллиметров. После выделения толстой кишки от другой усыпленной мыши соедините все кусочки ткани в 50-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую холодные эпителиальные диссоциационные среды, и инкубируйте кусочки ткани толстой кишки в эпителиальной диссоциационной среде в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия с мягким раскачиванием.
После инкубации дайте фрагментам ткани опуститься на дно трубки. После оседания отбросьте эпителиальные диссоциационные среды, не нарушая фрагменты тканей. Повторите процесс при промывке салфетки 10 - 15 раз холодным ПБС.
Выбросьте как можно больше PBS во время окончательной стирки. Затем добавьте холодную среду диссоциации крипты к вымытым кусочкам ткани толстой кишки в 50-миллилитровой трубке и встряхните в течение пяти-10 минут вручную. Под капотом клеточной культуры фильтруют среду, содержащую ткань, с помощью 70-микронного нейлонового клеточного сетчатого фильтра в свежую 50-миллилитрную центрифужную трубку.
После фильтрации центрифугируют трубку при 200 Г в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим выбросом супернатанта, не нарушая гранулированные крипты. Повторно суспендируйте гранулу в трех-четырех миллилитрах холодного PBS. Пипетка 10 микролитров суспензии крипты в линии на предметном стекле микроскопа.
Используя микроскоп, подсчитайте количество полных, длинных крипт, чтобы оценить концентрацию крипты и рассчитать соответствующий объем крипт, необходимых для пластины 10 крипт на микролитр в 96-луночной пластине. Центрифугировать соответствующий объем изолированных крипт в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке при 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите супернатант с помощью пипетки объемом 1000 микролитров, не нарушая гранулированные крипты.
Затем добавьте 100 микролитров гелевой матрицы в гранулированные крипты без введения пузырьков воздуха. Подождите одну-две минуты, пока гелевая матрица частично затвердеет. Затем пластину 10 микролитров гелевой матрицы смешивают с криптами в каждой лунке предварительно нагретой 96-луночной культуральной пластины, чтобы сформировать куполообразную форму.
Подождите от 10 до 20 минут, чтобы гелевая матрица была полностью установлена, поместив пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа. Наконец, добавьте 100 микролитров свежеприготовленного рабочего раствора среды L-WRN, дополненного антибиотиками, в каждую лунку и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия под 5% углекислым газом в течение 24 часов. Чтобы извлечь органоиды, удалите старые среды из скважин путем применения вакуумного всасывания и зафиксируйте органоиды с 4% параформальдегидом в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем удаляют 4% параформальдегида из скважин вакуумным всасыванием и обрабатывают органоиды 100 микролитрами 30% сахарозы на скважину при четырех градусах Цельсия. Через 24 часа удалите 30% сахарозы из скважин вакуумным всасыванием, прежде чем добавлять 10 микролитров PBS в каждую скважину. Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно поцарапать дно колодца, чтобы диссоциировать купольные органоиды.
Затем удалите PBS, содержащий диссоциированные органоиды, из колодца пипеткой и перенесите его в маркированную пластиковую форму, заполненную на 90% оптимальной температурой резания, или OCT, соединение. Продолжайте процесс до тех пор, пока все органоиды не будут удалены из всех колодцев. Добавьте 2-метилбутан в колбу dewar из нержавеющей стали, содержащую гранулы сухого льда, достаточно, чтобы покрыть гранулы.
Мгновенно заморозьте органоид, содержащий блок ОКТ, неуклонно удерживая его над 2-метилбутаном. Наконец, храните органоидный блок OCT при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к разделению. Репрезентативное изображение подчеркивает успешный рост колоноидов из нормальных крипт, содержащих клаудин-7.
Склепы, содержащие клаудин-7, начали образовывать сфероиды ко второму дню, начали распускаться на пятый день и продолжали расти и распускаться, пока их не собрали на девятый день. Напротив, склепы, в которых отсутствовал клодин-7, не смогли сформировать надлежащих колоноидов. После лечения 4-гидрокситамоксифеном в течение двух-трех дней нокаутирующие крипты клаудина-7 появились в виде круглых скоплений клеток.
В отличие от контрольных, крипты не выросли в здоровых сфероидов. Иммунофлуоресцентное окрашивание на клодин-7 в собранном контроле и условные нокаутирующие органоиды подтвердили успешное выбивание клаудина-7 в культуре. Контрольные колоноиды демонстрировали очень мало апоптотического сигнала на девятый день.
Однако нокаутирующие колоноиды клаудина-7 одновременно демонстрировали высокий апоптоз. Обеспечьте частичное затвердевание перед нанесением покрытия. Покрытие перед частичным затвердеванием приведет к распространению гелевой матрицы, и купол не будет сформирован, что повлияет на выживание и рост крипт.
Этот протокол может быть использован для открытия лекарств, изучения клеточной связи, метаболизма лекарств, жизнеспособности, пролиферации и разработки персонализированного лечения для конкретного пациента. Создание органоидной культуры произвело революцию в изучении болезней и персонализированной медицине.
