Este protocolo proporciona un método para estudiar la función de las células madre del colon en un entorno manipulable con menor costo en el tiempo que los modelos animales. El cultivo de organoides permite el estudio de la función de las células madre en un ambiente libre de inmunidad. Esto permite identificar los efectos de una causa específica, como el knockout de claudina-7.
Comprender los mecanismos de la función de las células madre puede arrojar luz sobre nuevos objetivos terapéuticos para enfermedades debilitantes como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal. Para comenzar el aislamiento de las criptas colónicas del ratón sacrificado, haga una incisión de aproximadamente dos pulgadas por la línea media del ratón. Luego, fije la piel para exponer el abdomen.
Corte el colon justo debajo del ciego desde el lado proximal y por encima del recto desde el lado distal para aislar el colon. A continuación, retire el tejido adiposo adherido al colon con fórceps. Después de expulsar las heces del colon aislado con el extremo plano de los fórceps, corte el tejido abierto longitudinalmente.
Lave el pañuelo de 10 a 15 veces con PBS frío girando el pañuelo alrededor del PBS entre lavados con fórceps. Luego, con un par de tijeras limpias y afiladas, corte el tejido en trozos pequeños que van desde aproximadamente tres a cinco milímetros. Después de aislar el colon de otro ratón sacrificado, combine todas las piezas de tejido en un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga medios de disociación epitelial fríos e incube las piezas de tejido del colon en medios de disociación epitelial durante 90 minutos a cuatro grados centígrados con un balanceo suave.
Después de la incubación, permita que los fragmentos de tejido se hundan hasta el fondo del tubo. Una vez asentado, deseche los medios de disociación epitelial sin interrumpir los fragmentos de tejido. Repita el proceso al lavar el pañuelo de 10 a 15 veces con PBS frío.
Deseche la mayor cantidad posible de PBS durante el lavado final. A continuación, agregue medios de disociación de cripta fría a las piezas de tejido de colon lavadas en un tubo de 50 mililitros y agite durante cinco a 10 minutos con la mano. Bajo la campana de cultivo celular, filtre el medio que contiene el tejido con un filtro de células de nylon de 70 micras en un tubo centrífugo fresco de 50 mililitros.
Después de la filtración, centrifugar el tubo a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de desechar el sobrenadante sin alterar las criptas granuladas. Resuspender el pellet en tres a cuatro mililitros de PBS frío. Pipetear 10 microlitros de la suspensión de cripta en una línea en un portaobjetos de microscopio.
Usando el microscopio, cuente el número de criptas completas y largas para estimar la concentración de criptas y calcule el volumen apropiado de criptas requeridas para colocar 10 criptas por microlitro en una placa de 96 pocillos. Centrifugar un volumen apropiado de criptas aisladas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, retire el sobrenadante con una pipeta de 1.000 microlitros sin interrumpir las criptas granuladas.
Luego, agregue 100 microlitros de matriz de gel a las criptas peletizadas sin introducir burbujas de aire. Espere uno o dos minutos hasta que la matriz de gel esté parcialmente solidificada. Luego, coloque 10 microlitros de la matriz de gel mezclada con las criptas en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos precalentada para formar una forma de cúpula.
Espere de 10 a 20 minutos para que la matriz de gel se fije completamente colocando la placa en una incubadora a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono. Finalmente, agregue 100 microlitros de la solución de trabajo recién preparada de medios L-WRN complementados con antibióticos a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Para cosechar los organoides, retire los medios viejos de los pocillos aplicando succión al vacío y fije los organoides con paraformaldehído al 4% durante una hora a temperatura ambiente.
Luego retire el 4% de paraformaldehído de los pozos por succión al vacío y trate los organoides con 100 microlitros de sacarosa al 30% por pocillo a cuatro grados centígrados. Después de 24 horas, retire el 30% de sacarosa de los pocillos por succión al vacío antes de agregar 10 microlitros de PBS a cada pozo. Use una punta de pipeta para rascar suavemente el fondo del pozo para disociar los organoides que contienen la cúpula.
A continuación, retire el PBS que contiene los organoides disociados del pozo con una pipeta y transfiéralo a un molde de plástico etiquetado lleno al 90% con una temperatura de corte óptima, o OCT, compuesto. Continúe el proceso hasta que todos los organoides hayan sido retirados de todos los pozos. Añadir 2-metilbutano a un matraz Dewar de acero inoxidable que contenga gránulos de hielo seco, suficientes para cubrir los gránulos.
Congele rápidamente el bloque de OCT que contiene organoide manteniéndolo constantemente por encima del 2-metilbutano. Finalmente, guarde el bloque OCT que contiene organoides a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para la sección. La imagen representativa destaca el crecimiento exitoso de colonoides de criptas normales que contienen claudina-7.
Las criptas que contienen claudina-7 comenzaron a formar esferoides en el segundo día, comenzaron a brotar el quinto día y continuaron creciendo y brotando hasta que se cosecharon el día nueve. En contraste, las criptas que carecen de claudina-7 no lograron formar colonoides adecuados. Después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno durante dos o tres días, las criptas knockout de claudina-7 aparecieron como grupos circulares de células.
A diferencia del control, las criptas no se convirtieron en esferoides saludables. La tinción de inmunofluorescencia para claudina-7 en el control cosechado y los organoides knockout condicionales confirmaron el knockout exitoso de claudina-7 en cultivo. Los colonoides de control exhibieron muy poca señal apoptótica en el día nueve.
Sin embargo, los colonoides knockout de claudina-7 mostraron una alta apoptosis al mismo tiempo. Asegurar la solidificación parcial antes del chapado. El recubrimiento antes de la solidificación parcial hará que la matriz de gel se extienda y la cúpula no se forme, afectando la supervivencia y el crecimiento de las criptas.
Este protocolo se puede utilizar para el descubrimiento de fármacos, el estudio de la comunicación celular, el metabolismo de los fármacos, la viabilidad, la proliferación y el desarrollo de un tratamiento personalizado específico para el paciente. El establecimiento del cultivo de organoides ha revolucionado el estudio de las enfermedades y la medicina personalizada.
