يشرح بروتوكولنا كيفية تصميم وبناء وتحليل الدوائر الرقمية لجينات الخميرة التي تستخدم أنظمة CRISPR dCas من النوع الثاني والنوع الخامس والبروتينات المضادة ل CRISPR المقابلة. إنه يبقى التجميع لأنه لا يجمع أي إجراءات قياسية لتجميع واختبار شبكات النسخ الاصطناعية في الخدمات. للبدء ، قم بإعداد خليط تفاعل يحتوي على 20 إلى 40 نانوجرام من قالب الحمض النووي ، وميكرولتر واحد من التمهيدي الأمامي ، وميكرولتر واحد من التمهيدي العكسي ، وخمسة ميكرولتر من مزيج DNTP ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من 5x عازلة تفاعل بوليميراز الحمض النووي ، وماء مقطر مزدوج يصل حجمه الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.
قم بتضخيم تسلسل الحمض النووي باستخدام برنامج PCR للهبوط على جهاز تدوير حراري كما هو موضح في المخطوطة. اعزل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي وقم بتخفيف تسلسل الحمض النووي من هلام الأغاروز عبر مجموعة استخراج هلام الحمض النووي. باستخدام طريقة تجميع جيبسون ، أدخل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى في ناقل المكوك المفتوح عن طريق السماح بدخول خليط الحمض النووي المتساوي المولي عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
قم ببناء متجه متقبل dCas12a عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للهبوط وطريقة تجميع جيبسون كما هو موضح سابقا. أدخل بروتينات dCas12a المحسنة لكودون الخميرة في المتجهين المستقبلين اللذين تم إنشاؤهما حديثا عن طريق الهضم باستخدام BamH1 و Xhol1 والربط باستخدام T4 DNA ligase. وبالمثل ، قم ببناء البلازميدات بناء على ناقل المكوك pRS2403 للتعبير عن البروتينات المضادة لكريسبر عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل وطريقة تجميع جيبسون.
لإجراء الكشف عن الخلايا المجهرية ، ضع ميكرولتر من محلول الخلية على شريحة زجاجية وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري عن طريق تشغيل مصدر ضوء الفلورسنت والمجهر والكمبيوتر. بعد تدوين رقم مصدر ضوء الفلورسنت ، افتح برنامج المجهر على الكمبيوتر.
ضع الشريحة على مرحلة المجهر واختر العدسة الموضوعية 40x أثناء مراقبة الخلايا تحت الضوء الأخضر. حرك مقبض تركيز الدورة التدريبية حتى يظهر محيط خلايا الخميرة ومقبض التركيز الدقيق لتركيز الخلايا. للكشف عن الخلايا ، بعد إغلاق مجال رؤية المجهر ، قم بالتبديل إلى شاشة الكمبيوتر وانقر على البث المباشر.
انتظر لمدة ثلاث إلى خمس ثوان. انقر فوق التقاط لالتقاط صورة وحفظ الصورة. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر والمجهر ومصدر ضوء الفلورسنت.
قم بتشغيل جهاز FACS قبل 20 دقيقة من القياسات لتسخين الليزر وخلط 20 ميكرولترا من زراعة الخلايا مع 300 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. قم بتشغيل برنامج FACS على الكمبيوتر المتصل بجهاز FACS وقم بإنشاء تجربة جديدة. ثم اضبط معلمات القياس.
بعد ذلك ، حدد المرشح وفقا للأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للعينات واضبط رقم خلية الاستحواذ على 10،000. ضبط جهد مرشح FITC عن طريق قياس شدة حبات الفلورسنت ، مع التأكد من أن الفرق النسبي في شدة الخرز بين تجربتين متتاليتين لا يتجاوز 5٪ اغسل الغسالة بالماء المقطر المزدوج لبضع ثوان لإزالة أي حبات زائدة محتملة. قم بقياس شدة مضان العينة وانقر فوق معاينة أثناء الانتظار لمدة ثلاث إلى خمس ثوان لاستقرار حقن العينة.
أخيرا انقر فوق اكتساب. قم بقياس الخرزات مرة أخرى في نهاية التجربة. بعد التحقق مما إذا كان الفرق النسبي بين قياسات الخرز يتجاوز 5٪ تصدير بيانات FACS كملفات FCS.
افتح استوديو R وقم بتحميل البرنامج النصي BDverse_analysis. R لتحليل ملفات FCS. قم بتعيين اسم التجربة ك ename ، مسار الدليل حيث يتم تخزين ملفات FCS كما dir_d وسيتم إنشاء ملفات النتائج كما dir_r.
بعد ذلك ، اضبط قناة التألق. اضبط عدد العينات التي تم قياسها. أبعاد المخططات النقطية والطول الأقصى للمحور x و y للمخططات الشريطية والمخططات الصندوقية.
اختر طريقة التقدير عن طريق إزالة علامة التصنيف من الأسطر المقابلة. حدد كائن flowSet المسور المقابل لطريقة البوابات المختارة ودقة الرسم النقطي ، والتي يجب أن تساوي 256 على الأقل. قم بإلغاء تعليق تعليمات التصفية لإزالة القياسات التي يكون فيها التألق سالبا ولإزالة القيم المتطرفة بسبب تجارب أخرى كما هو موضح في المخطوطة.
اضغط على المصدر وقم بتشغيل البرنامج النصي. يتم إنشاء جميع الملفات التي تحتوي على نتائج التحليل في dir_r. تم تحقيق أفضل كفاءة تنشيط ل dSpCas9-VP64 عندما كان هناك ستة مواقع مستهدفة lexOp على المروج الاصطناعي.
بينما بالنسبة ل dCas12a-VPR أعلى كفاءة تنشيط عندما تم إدخال ثلاث نسخ من lexOp في المروج الاصطناعي. كان التنشيط بواسطة CRISPR RNA و RNA الموجه الفردي الموجود على بلازميد تكاملي 1.4 إلى 2.4 ، و 1.1 إلى 1.5 مرة أعلى مما كان عليه عند وضعه على البلازميد العرضي. أظهرت نتائج RT-qPCR أن المتجه العرضي أنتج مستوى أعلى بكثير من دليل واحد RNA CRISPR RNA من المتجه التكاملي ، بغض النظر عن نظام التعبير.
تم اختبار كفاءة تنشيط dSpCas9 المعقد وتوظيف الحمض النووي الريبي السقالة MCP-VP64. أعطى الحمض النووي الريبي سقالة الذي يحتوي على نوع بري واحد ودبوس شعر F6MS2 تنشيطا 5.27 و 4.3 أضعاف على التوالي. ومع ذلك ، أدى الجمع بين دبابيس الشعر إلى 7.54 أضعاف بأعلى كفاءة تنشيط.
تم استخدام أربعة مروجين مختلفين لدفع التعبير عن ثلاثة أنواع من النوع الثاني المضاد لكريسبر مما يدل على أنهم يعملون بطريقة تعتمد على الجرعة. قام مروج قوي بخفض مستوى التألق إلى 0.21 و 0.11 و 0.13 من قيمته على التوالي. يوضح منحنى المعايرة بالتحليل الحجمي أن الدائرة تتصرف مثل مشية عقدة مع نسبة تشغيل إلى إيقاف تقترب من 2.3.
النوع الخامس المضاد لكريسبر A واحد يقلل من التعبير الفلوري لكل من denAS-Cas12a و dLB-Cas12a كمنشطات من 19٪ إلى 71٪ تمت دراسة العلاقة بين المنشطات والمثبطات حيث أظهر Acr-VA تقلبات كبيرة في أدائه عندما تم إنتاجه بواسطة pGAL1 تحت pTEF1 وأظهر CYC1t-pCYC1noTata الجيني من النوع الخامس المضاد ل CRISPR-A1 بعض القمع على dLB Cas12a فقط. آلة FACS ضعيفة ، لذلك يجب التعامل معها بعناية. يجب ألا يكون محلول الخلية كثيفا جدا ويجب أن تظل الآلة نظيفة.
