מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

Summary

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

Abstract

גנים סינתטיים לשערים בוליאניים ולמעגלים דיגיטליים יש מגוון רחב של יישומים, החל מאבחון רפואי ועד לטיפול סביבתי. גילוי מערכות CRISPR-Cas והמעכבים הטבעיים שלהן - חלבוני האנטי-קריספר (Acrs) - מספק כלי חדש לתכנון ויישום מעגלים דיגיטליים של גנים in vivo . כאן, אנו מתארים פרוטוקול העוקב אחר הרעיון של מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" ועושה שימוש ב- dCas9/dCas12a יחד עם ה- Acrs המתאימים שלהם כדי ליצור רשתות שעתוק קטנות, שחלקן מתנהגות כמו שערים בוליאניים, ב - Saccharomyces cerevisiae. תוצאות אלה מציינות את המאפיינים של dCas9/dCas12a כגורמי שעתוק. בפרט, כדי להשיג הפעלה מקסימלית של ביטוי גנים, dSpCas9 צריך לקיים אינטראקציה עם RNA פיגום מהונדס שאוסף עותקים מרובים של תחום ההפעלה VP64 (AD). לעומת זאת, dCas12a יאוחה, במסוף C, עם VP64-p65-Rta (VPR) AD חזק. יתר על כן, הפעילות של שני חלבוני Cas אינה משופרת על ידי הגדלת כמות sgRNA/crRNA בתא. מאמר זה גם מסביר כיצד לבנות שערים בוליאניים בהתבסס על אינטראקציית CRISPR-dCas-Acr. תחום קשירת ההורמונים המאוחה AcrIIA4 של קולטן האסטרוגן האנושי הוא הליבה של שער NOT המגיב ל-β-אסטרדיול, בעוד ש-AcrVAs המסונתזים על ידי מקדם GAL1 המושרה מאפשרים לחקות שערי כן ו-NOT עם גלקטוז כקלט. במעגלים האחרונים, AcrVA5, יחד עם dLbCas12a, הראו את ההתנהגות הלוגית הטובה ביותר.

Introduction

בשנת 2011, חוקרים הציעו שיטה חישובית ופיתחו תוכנה מתאימה לתכנון אוטומטי של מעגלי גנים סינתטיים דיגיטליים¹. המשתמש היה צריך לציין את מספר הקלטים (שלוש או ארבע) ולמלא את טבלת האמת המעגלית; זה סיפק את כל המידע הדרוש כדי לגזור את מבנה המעגל באמצעות טכניקות מאלקטרוניקה. טבלת האמת תורגמה לשתי נוסחאות בוליאניות בשיטת מפת קרנאו². כל נוסחה בוליאנית מורכבת ממשפטים המתארים פעולות לוגיות (סכום או כפל) בין (חלק) קלטי המעגל ושלילותיהם (הליטרלים). סעיפים, בתורם, מסוכמים (OR) או מוכפלים (AND) כדי לחשב את פלט המעגל. כל מעגל יכול להתממש על פי כל אחת משתי הנוסחאות המתאימות: האחת כתובה בצורת קופה (מכפלה של סכומים) והשנייה בצורת SOP....