Наш протокол объясняет, как проектировать, создавать и анализировать цифровые схемы генов дрожжей, в которых используются системы CRISPR dCas второго и пятого типов и соответствующие белки анти-CRISPR. Это сборка, потому что она собирает ноль стандартных процедур для сборки и тестирования синтетических транскрипционных сетей в сервисах. Для начала приготовьте реакционную смесь, содержащую от 20 до 40 нанограммов матрицы ДНК, один микролитр прямого праймера, один микролитр обратного праймера, пять микролитров смеси DNTP, 0,5 микролитра ДНК-полимеразы, 10 микролитров 5-кратного реакционного буфера ДНК-полимеразы и двойную дистиллированную воду до общего объема 50 микролитров.
Амплификация последовательностей ДНК с помощью программы ПЦР на термоциклере, как описано в рукописи. Изолируйте продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза и разбавьте последовательности ДНК из агарозного геля с помощью набора для экстракции геля ДНК. Используя метод сборки Гибсона, вставьте очищенные продукты ПЦР в разрезанный вектор челнока, впустив эквимолярную смесь ДНК при температуре 50 градусов Цельсия в течение одного часа.
Постройте вектор-акцептор dCas12a с помощью ПЦР с приземлением и метода сборки Гибсона, как показано ранее. Вставьте оптимизированные для дрожжевого кодона белки dCas12a в два вновь построенных акцепторных вектора путем расщепления BamH1 и Xhol1 и лигирования ДНК-лигазой Т4. Точно так же сконструируйте плазмиды на основе челночного вектора pRS2403 для экспрессии белков анти-CRISPR с помощью ПЦР с приземлением и метода сборки Гибсона.
Чтобы выполнить микроскопическое обнаружение клеток, поместите два микролитра клеточного раствора на предметное стекло и накройте его покровным стеклом. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, включив флуоресцентный источник света, микроскоп и компьютер. Записав номер источника флуоресцентного света, откройте программное обеспечение микроскопа на компьютере.
Поместите предметное стекло на столик микроскопа и выберите 40-кратный объектив, наблюдая за клетками под зеленым светом. Перемещайте ручку фокусировки курса, пока не появится контур дрожжевых клеток и тонкая ручка фокусировки, чтобы сфокусировать клетки. Чтобы обнаружить клетки, после закрытия поля зрения микроскопа переключитесь на экран компьютера и нажмите на живое.
Подождите три-пять секунд. Нажмите на захват, чтобы сделать снимок и сохранить снимок. Затем выключите компьютер, микроскоп и источник флуоресцентного света.
Включите аппарат FACS за 20 минут до измерений, чтобы разогреть лазер и смешать 20 микролитров клеточной культуры с 300 микролитрами двойной дистиллированной воды. Запустите программное обеспечение FACS на компьютере, подключенном к компьютеру FACS, и создайте новый эксперимент. Затем установите параметры измерения.
Затем выберите фильтр в соответствии с длинами волн возбуждения и излучения образцов и установите номер ячейки сбора данных на 10 000. Отрегулируйте напряжение фильтра FITC, измерив интенсивность флуоресцентных шариков, убедившись, что относительная разница в интенсивности шариков между двумя последовательными экспериментами не превышает 5%Промойте машину двойной дистиллированной водой в течение нескольких секунд, чтобы удалить любые возможные лишние шарики. Измерьте интенсивность флуоресценции образца и нажмите на предварительный просмотр, ожидая от трех до пяти секунд для стабильности впрыска образца.
Наконец, нажмите «Приобрести». Измерьте бусины еще раз в конце эксперимента. Проверив, превышает ли относительная разница между измерениями двух шариков 5%Экспортируйте данные FACS в виде файлов FCS.
Откройте R studio и загрузите сценарий BDverse_analysis. R для анализа файлов FCS. Задайте имя эксперимента как ename, путь к каталогу, в котором хранятся файлы FCS, как dir_d и файлы результатов будут созданы как dir_r.
Далее устанавливаем флуоресцентный канал. Установите количество измеряемых образцов. Размеры точечных диаграмм и максимальная длина осей x и y для гистограмм и блочных диаграмм.
Выберите метод оценки, удалив хэштег из соответствующих строк. Выберите объект flowSet gated, соответствующий выбранному методу стробирования, и разрешение точечного графика, которое должно быть не менее 256. Раскомментируйте две инструкции по фильтрации, чтобы удалить измерения, в которых флуоресценция отрицательна, и удалить выбросы, вызванные другими экспериментами, как описано в рукописи.
Нажмите источник и запустите сценарий. Все файлы, содержащие результаты анализа, создаются в dir_r. Наилучшая эффективность активации dSpCas9-VP64 была достигнута при наличии шести целевых сайтов lexOp на синтетическом промоторе.
В то время как для dCas12a-VPR наибольшая эффективность активации, когда три копии lexOp были вставлены в синтетический промотор. Активация CRISPR РНК и одной направляющей РНК, расположенной на интегративной плазмиде, была в 1,4–2,4 и от 1,1 до 1,5 раза выше, чем при размещении на эписомальной плазмиде. Результаты ОТ-кПЦР показали, что эписомальный вектор продуцирует гораздо более высокий уровень однонаправляющей РНК CRISPR RNA, чем интегративный вектор, независимо от системы экспрессии.
Проверена эффективность активации комплекса dSpCas9 и каркасной РНК-рекрутинга MCP-VP64. РНК каркаса, содержащая один дикий тип и шпильку F6MS2, дала 5,27 и 4,3-кратную активацию соответственно. Тем не менее, комбинация двух шпилек привела к 7,54 раза с самой высокой эффективностью активации.
Четыре различных промотора использовались для стимулирования экспрессии трех видов анти-CRISPR второго типа, показывая, что они работают дозозависимым образом. Сильный промотор снижал уровень флуоресценции до 0,21, 0,11 и 0,13 от его значения соответственно. Кривая титрования показывает, что цепь ведет себя как узелковая походка с отношением включения и выключения, приближающимся к 2,3.
Анти-CRISPR A пятого типа снижает экспрессию флуоресценции как denAS-Cas12a, так и dLB-Cas12a в качестве активаторов с 19% до 71%Была изучена связь между активаторами и репрессорами, где Acr-VA демонстрировал большие колебания в своих характеристиках при продуцировании pGAL1 при pTEF1, а генетический CYC1t-pCYC1noTata пятого типа анти-CRISPR-A1 показал некоторое подавление только на голом dLB Cas12a. Машина FACS хрупкая, поэтому с ней следует обращаться осторожно. Клеточный раствор никогда не должен быть слишком плотным, а машина должна содержаться в чистоте.
