Digitale Genschaltkreise auf Basis von CRISPR-Cas-Systemen und Anti-CRISPR-Proteinen

Zusammenfassung

CRISPR-Cas-Systeme und Anti-CRISPR-Proteine wurden in das Schema der Booleschen Gates in Saccharomyces cerevisiae integriert. Die neuen kleinen Logikschaltkreise zeigten eine gute Leistung und vertieften das Verständnis sowohl von dCas9/dCas12a-basierten Transkriptionsfaktoren als auch von den Eigenschaften von Anti-CRISPR-Proteinen.

Zusammenfassung

Boolesche Gatter mit synthetischen Genen und digitale Schaltkreise haben ein breites Anwendungsspektrum, von der medizinischen Diagnostik bis zum Umweltschutz. Die Entdeckung der CRISPR-Cas-Systeme und ihrer natürlichen Inhibitoren – der Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) – bietet ein neues Werkzeug für den Entwurf und die Implementierung digitaler Schaltkreise für Gene in vivo . Hier beschreiben wir ein Protokoll, das der Idee des "Design-Build-Test-Learn"-Bio-Engineering-Zyklus folgt und dCas9/dCas12a zusammen mit den entsprechenden Acrs verwendet, um kleine Transkriptionsnetzwerke zu etablieren, von denen sich einige wie Boolesche Gatter verhalten, in Saccharomyces cerevisiae. Diese Ergebnisse weisen auf die Eigenschaften von dCas9/dCas12a als Transkriptionsfaktoren hin. Um eine maximale Aktivierung der Genexpression zu erreichen, muss dSpCas9 insbesondere mit einer künstlich hergestellten Gerüst-RNA interagieren, die mehrere Kopien der VP64-Aktivierungsdomäne (AD) sammelt. Im Gegensatz dazu soll dCas12a an der C-Endstation mit dem starken VP64-p65-Rta (VPR) AD fusioniert werden. Darüber hinaus wird die Aktivität beider Cas-Proteine nicht durch eine Erhöhung der Menge an sgRNA/crRNA in der Zelle erhöht. In diesem Artikel wird auch erläutert, wie boolesche Gatter basierend auf der CRISPR-dCas-Acr-Wechselwirkung erstellt werden. Die mit AcrIIA4 fusionierte Hormonbindungsdomäne des humanen Östrogenrezeptors ist der Kern eines NOT-Gates, das auf β-Östradiol reagiert, während AcrVAs, die durch den induzierbaren GAL1-Promotor synthetisiert werden, es ermöglichen, sowohl YES- als auch NOT-Gatter mit Galaktose als Input nachzuahmen. In den letztgenannten Schaltungen zeigte AcrVA5 zusammen mit dLbCas12a das beste logische Verhalten.

Einleitung

Im Jahr 2011 schlugen Forscher eine Berechnungsmethode vor und entwickelten eine entsprechende Software für den automatischen Entwurf digitaler synthetischer Genschaltkreise¹. Ein Benutzer musste die Anzahl der Eingänge (drei oder vier) angeben und die Wahrheitstabelle des Schaltkreises ausfüllen. Dies lieferte alle notwendigen Informationen, um den Schaltungsaufbau mit Hilfe von Techniken aus der Elektronik abzuleiten. Die Wahrheitstabelle wurde mit Hilfe der Karnaugh-Map-Methode² in zwei boolesche Formeln übersetzt. Jede boolesche Formel besteht aus Klauseln, die logische Operationen (Summe oder Multiplikation....