Nuestro protocolo explica cómo diseñar, construir y analizar circuitos digitales de genes de levadura que utilizan sistemas CRISPR dCas tipo dos y tipo cinco y las proteínas anti-CRISPR correspondientes. Es una suspensión de ensamblaje porque reúne cero procedimientos estándar para ensamblar y probar redes transcripcionales sintéticas en servicios. Para comenzar, prepare una mezcla de reacción que contenga de 20 a 40 nanogramos de plantilla de ADN, un microlitro de imprimación directa, un microlitro de cebador inverso, cinco microlitros de mezcla de DNTP, 0.5 microlitros de ADN polimerasa, 10 microlitros de tampón de reacción de ADN polimerasa 5x y agua destilada doble hasta un volumen total de 50 microlitros.
Amplíe las secuencias de ADN utilizando el programa de PCR de toma de contacto en un termociclador como se describe en el manuscrito. Aislar los productos de PCR mediante electroforesis en gel y diluir las secuencias de ADN del gel de agarosa a través de un kit de extracción de gel de ADN. Usando el método de ensamblaje de Gibson, inserte los productos de PCR purificados en el vector lanzadera abierto de corte dejando entrar la mezcla de ADN equimolar a 50 grados centígrados durante una hora.
Construya el vector aceptor dCas12a mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson como se demostró anteriormente. Inserte las proteínas dCas12a optimizadas para codones de levadura en los dos vectores aceptores recién construidos mediante digestión con BamH1 y Xhol1 y ligadura con ADN ligasa T4. Del mismo modo, construya los plásmidos basados en el vector lanzadera pRS2403 para expresar las proteínas anti-CRISPR a través de PCR de contacto y el método de ensamblaje de Gibson.
Para realizar la detección de células de microscopía, coloque dos microlitros de la solución celular en un portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia encendiendo la fuente de luz fluorescente, el microscopio y la computadora. Después de anotar el número de fuente de luz fluorescente, abra el software del microscopio en la computadora.
Coloque la diapositiva en el escenario del microscopio y elija la lente del objetivo 40x mientras observa las células bajo la luz verde. Mueva la perilla de enfoque del curso hasta que aparezca el contorno de las células de levadura y la perilla de enfoque fino para enfocar las células. Para detectar las células, después de cerrar el campo de visión del microscopio, cambie a la pantalla de la computadora y haga clic en vivo.
Espere de tres a cinco segundos. Haga clic en capturar para tomar una foto y guardar la imagen. A continuación, apague la computadora, el microscopio y la fuente de luz fluorescente.
Encienda la máquina FACS 20 minutos antes de las mediciones para calentar el láser y mezcle 20 microlitros del cultivo celular con 300 microlitros de agua destilada doble. Ejecute el software FACS en el ordenador conectado a la máquina FACS y cree un nuevo experimento. A continuación, establezca los parámetros de medición.
A continuación, seleccione el filtro de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión de las muestras y establezca el número de celda de adquisición en 10, 000. Ajuste el voltaje del filtro FITC midiendo la intensidad de las perlas fluorescentes, asegurándose de que la diferencia relativa en la intensidad de las perlas entre dos experimentos consecutivos no exceda el 5%Lave la máquina con agua destilada doble durante unos segundos para eliminar cualquier posible exceso de perlas. Mida la intensidad de fluorescencia de la muestra y haga clic en la vista previa mientras espera de tres a cinco segundos para la estabilidad de la inyección de la muestra.
Finalmente haga clic en adquirir. Mide las cuentas de nuevo al final del experimento. Después de comprobar si la diferencia relativa entre las dos medidas de perlas supera el 5%Exporte los datos FACS como archivos FCS.
Abra R studio y cargue el script BDverse_analysis. R para analizar los archivos FCS. Establezca el nombre del experimento como ename, la ruta del directorio donde se almacenan los archivos FCS como dir_d y los archivos de resultados se crearán como dir_r.
A continuación, configure el canal de fluorescencia. Establezca el número de muestras que se midieron. Las dimensiones de los diagramas de puntos y la longitud máxima de los ejes x e y para gráficos de barras y diagramas de caja.
Elija el método de calificación eliminando el hashtag de las líneas correspondientes. Seleccione el objeto flowSet gated correspondiente al método de compuerta elegido y la resolución del diagrama de puntos, que debe ser al menos igual a 256. Descomente las dos instrucciones de filtrado para eliminar las mediciones donde la fluorescencia es negativa y para eliminar los valores atípicos debidos a otros experimentos como se describe en el manuscrito.
Presione source y ejecute el script. Todos los archivos que contienen los resultados del análisis se crean en dir_r. La mejor eficiencia de activación de dSpCas9-VP64 se logró cuando había seis sitios de destino lexOp en el promotor sintético.
Mientras que para dCas12a-VPR mayor eficiencia de activación cuando se insertaron tres copias de lexOp en el promotor sintético. La activación por ARN CRISPR y ARN guía único localizado en un plásmido integrativo fue de 1,4 a 2,4, y de 1,1 a 1,5 veces mayor que cuando se colocó en un plásmido episomal. Los resultados de RT-qPCR mostraron que un vector episomal produjo un nivel mucho más alto de ARN guía única ARN CRISPR que el vector integrador, independientemente del sistema de expresión.
Se probó la eficiencia de activación del complejo dSpCas9 y el ARN de andamio que recluta MCP-VP64. El ARN del andamio que contenía un solo tipo salvaje y una horquilla F6MS2 dio una activación de 5,27 y 4,3 veces respectivamente. Sin embargo, la combinación de las dos horquillas resultó en 7,54 veces con la mayor eficiencia de activación.
Se utilizaron cuatro promotores diferentes para impulsar la expresión de tres tipos de anti CRISPR tipo dos, lo que demuestra que funcionaban de manera dependiente de la dosis. Un promotor fuerte redujo el nivel de fluorescencia a 0.21, 0.11 y 0.13 de su valor, respectivamente. La curva de valoración muestra que el circuito se comporta como una marcha de nudo con una relación de encendido a apagado cercana a 2.3.
El tipo cinco anti-CRISPR A reduce la expresión de fluorescencia de denAS-Cas12a y dLB-Cas12a como activadores del 19% al 71%Se estudió la relación entre activadores y represores, donde el Acr-VA mostró grandes fluctuaciones en su rendimiento cuando fue producido por pGAL1 bajo pTEF1 y el CYC1t-pCYC1noTata tipo cinco anti-CRISPR-A1 mostró cierta represión en el dLB Cas12a desnudo solamente. La máquina FACS es frágil, por lo que debe manipularse con cuidado. La solución celular nunca debe ser demasiado densa y la máquina debe mantenerse limpia.
