Protokolümüz, tip iki ve tip beş CRISPR dCas sistemlerini ve buna karşılık gelen anti-CRISPR proteinlerini kullanan maya geni dijital devrelerinin nasıl tasarlanacağını, oluşturulacağını ve analiz edileceğini açıklamaktadır. Hizmetlerdeki sentetik transkripsiyonel ağları bir araya getirmek ve test etmek için sıfır standart prosedür topladığı için montaj kalışıdır. Başlamak için, 20 ila 40 nanogram DNA şablonu, bir mikrolitre ileri astar, bir mikrolitre ters astar, beş mikrolitre DNTP karışımı, 0.5 mikrolitre DNA polimeraz, 10 mikrolitre 5x DNA polimeraz reaksiyon tamponu ve toplam 50 mikrolitre hacme kadar çift damıtılmış su içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın.
Makalede açıklandığı gibi bir termosikler üzerindeki touchdown PCR programını kullanarak DNA dizilerini güçlendirin. PCR ürünlerini jel elektroforezi yoluyla izole edin ve DNA dizilerini agaroz jelinden bir DNA jel ekstraksiyon kiti ile seyreltin. Gibson montaj yöntemini kullanarak, saflaştırılmış PCR ürünlerini, ekomolar DNA karışımını bir saat boyunca 50 santigrat derecede bırakarak kes-açık mekik vektörüne yerleştirin.
Daha önce gösterildiği gibi touchdown PCR ve Gibson montaj yöntemi ile dCas12a alıcı vektörünü oluşturun. Maya kodonu optimize edilmiş dCas12a proteinlerini, BamH1 ve Xhol1 ile sindirim ve T4 DNA ligaz ile ligasyon yoluyla yeni inşa edilen iki alıcı vektöre yerleştirin. Benzer şekilde, anti-CRISPR proteinlerini touchdown PCR ve Gibson montaj yöntemi ile ifade etmek için pRS2403 mekik vektörüne dayanan plazmidleri oluşturun.
Mikroskopi hücresi tespiti yapmak için, hücre çözeltisinin iki mikrolitresini bir cam slayt üzerine yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün. Floresan ışık kaynağını, mikroskobu ve bilgisayarı açarak floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin. Floresan ışık kaynağı numarasını yazdıktan sonra, bilgisayardaki mikroskop yazılımını açın.
Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve yeşil ışık altındaki hücreleri gözlemlerken 40x objektif lensi seçin. Maya hücrelerinin konturu görünene kadar kurs odak düğmesini ve hücreleri odaklamak için ince odak düğmesini hareket ettirin. Hücreleri algılamak için, mikroskop görüş alanını kapattıktan sonra bilgisayar ekranına geçin ve canlıya tıklayın.
Üç ila beş saniye bekleyin. Fotoğraf çekmek ve fotoğrafı kaydetmek için yakalamaya tıklayın. Ardından, bilgisayarı, mikroskobu ve floresan ışık kaynağını kapatın.
Lazeri ısıtmak için ölçümlerden 20 dakika önce FACS makinesini açın ve hücre kültürünün 20 mikrolitresini 300 mikrolitre çift damıtılmış su ile karıştırın. FACS makinesine bağlı bilgisayarda FACS yazılımını çalıştırın ve yeni bir deneme oluşturun. Ardından ölçüm parametrelerini ayarlayın.
Ardından, numunelerin uyarma ve emisyon dalga boylarına göre filtreyi seçin ve edinme hücresi numarasını 10.000 olarak ayarlayın. Floresan boncukların yoğunluğunu ölçerek FITC filtre voltajını ayarlayın, ardışık iki deney arasındaki boncukların yoğunluğundaki nispi farkın% 5'i geçmemesini sağlayınOlası fazla boncukları çıkarmak için makineyi birkaç saniye boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın. Numune floresan yoğunluğunu ölçün ve numune enjeksiyon stabilitesi için üç ila beş saniye beklerken önizlemeye tıklayın.
Son olarak edin'e tıklayın. Deneyin sonunda boncukları tekrar ölçün. İki boncuk ölçümü arasındaki nispi farkın% 5'i aşıp aşmadığını kontrol ettikten sonraFACS verilerini FCS dosyaları olarak dışa aktarın.
R Studio'yu açın ve BDverse_analysis komut dosyasını yükleyin. FCS dosyalarını analiz etmek için R. Deneme adını, FCS dosyalarının dir_d olarak depolandığı ve sonuç dosyalarının dir_r olarak oluşturulacağı dizin yolu olan ename olarak ayarlayın.
Ardından, floresan kanalını ayarlayın. Ölçülen numune sayısını ayarlayın. Çubuk grafikler ve kutu grafikler için nokta grafiklerinin boyutları ve x ve y ekseninin maksimum uzunluğu.
Hashtag'i ilgili satırlardan kaldırarak not verme yöntemini seçin. Seçilen geçit yöntemine karşılık gelen geçitli flowSet nesnesini ve en az 256'ya eşit olması gereken nokta çizim çözünürlüğünü seçin. Floresanın negatif olduğu ölçümleri kaldırmak ve makalede açıklandığı gibi diğer deneyler nedeniyle aykırı değerleri kaldırmak için iki filtreleme talimatının açıklamasını kaldırın.
Kaynak tuşuna basın ve komut dosyasını çalıştırın. Analiz sonuçlarını içeren tüm dosyalar dir_r oluşturulur. dSpCas9-VP64'ün en iyi aktivasyon verimliliği, sentetik promotörde altı lexOp hedef bölgesi olduğunda elde edildi.
dCas12a-VPR için, sentetik promotöre üç lexOp kopyası yerleştirildiğinde en yüksek aktivasyon verimliliği. Bütünleştirici bir plazmid üzerinde bulunan CRISPR RNA ve tek kılavuz RNA tarafından aktivasyon, bir epizomal plazmid üzerine yerleştirildiğinden 1.4 ila 2.4 ve 1.1 ila 1.5 kat daha yüksekti. RT-qPCR sonuçları, epizomal bir vektörün, ekspresyon sisteminden bağımsız olarak, bütünleştirici vektörden çok daha yüksek bir tek kılavuzlu RNA CRISPR RNA ürettiğini göstermiştir.
MCP-VP64'ü işe alan karmaşık dSpCas9 ve iskele RNA'sının aktivasyon etkinliği test edildi. Tek bir vahşi tip ve F6MS2 saç tokası içeren iskele RNA'sı sırasıyla 5.27 ve 4.3 kat aktivasyon verdi. Bununla birlikte, iki saç tokasının kombinasyonu, en yüksek aktivasyon verimliliği ile 7.54 kat ile sonuçlandı.
Üç çeşit tip iki anti CRISPR'nin ekspresyonunu yönlendirmek için dört farklı promotör kullanıldı ve doza bağımlı bir şekilde çalıştıklarını gösterdi. Güçlü bir promotör, floresan seviyesini sırasıyla değerinin 0.21, 0.11 ve 0.13'üne düşürdü. Titrasyon eğrisi, devrenin 2,3'e yaklaşan bir açma-kapama oranıyla düğüm yürüyüşü gibi davrandığını gösterir.
Tip beş anti-CRISPR A, hem denAS-Cas12a hem de dLB-Cas12a'nın floresan ekspresyonunu aktivatörler olarak% 19'dan% 71'e düşürürAktivatörler ve baskılayıcılar arasındaki ilişki, Acr-VA'nın pTEF1 altında pGAL1 tarafından üretildiğinde performansında büyük dalgalanmalar gösterdiği ve genetik CYC1t-pCYC1noTata tip beş anti-CRISPR-A1'in sadece çıplak dLB Cas12a üzerinde bir miktar baskı gösterdiği yerde incelenmiştir. FACS makinesi zayıftır, bu nedenle dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Hücre çözeltisi asla çok yoğun olmamalı ve makine temiz tutulmalıdır.
