我们的协议解释了如何设计、构建和分析利用二型和五型CRISPR dCas系统以及相应的抗CRISPR蛋白的酵母基因数字电路。它是组装停留，因为它收集了零标准程序来组装和测试服务中的合成转录网络。首先，制备含有20至40纳克DNA模板，1微升正向引物，1微升反向引物，5微升DNTP混合物，0.5微升DNA聚合酶，10微升5x DNA聚合酶反应缓冲液和双蒸水的反应混合物，总体积为50微升。
如手稿中所述，在热循环仪上使用触地PCR程序扩增DNA序列。通过凝胶电泳分离PCR产物，并通过DNA凝胶提取试剂盒稀释琼脂糖凝胶中的DNA序列。使用Gibson组装方法，将纯化的PCR产物插入切开式穿梭载体中，方法是让等摩尔DNA混合物在50摄氏度下进入一小时。
如前所述，通过触地PCR和Gibson组装方法构建dCas12a受体载体。通过用 BamH1 和 Xhol1 消化并用 T4 DNA 连接酶连接，将酵母密码子优化的 dCas12a 蛋白插入到两个新构建的受体载体中。类似地，基于pRS2403穿梭载体构建质粒，通过触地PCR和Gibson组装法表达抗CRISPR蛋白。
要进行显微镜细胞检测，请将两微升细胞溶液放在载玻片上，并用盖玻片盖住。通过打开荧光光源，显微镜和计算机在荧光显微镜下观察细胞。记下荧光光源编号后，打开电脑上的显微镜软件。
将载玻片放在显微镜载物台上，选择40倍物镜，同时在绿光下观察细胞。移动课程焦点旋钮，直到出现酵母细胞的轮廓，并移动精细聚焦旋钮以聚焦细胞。要检测细胞，关闭显微镜视野后切换到计算机屏幕并单击实时。
等待三到五秒钟。单击捕获以拍照并保存图片。接下来，关闭计算机、显微镜和荧光光源。
测量前20分钟打开FACS机器以预热激光并将20微升细胞培养物与300微升双蒸水混合。在连接到 FACS 计算机的计算机上运行 FACS 软件并创建新实验。然后设置测量参数。
接下来，根据样品的激发和发射波长选择滤光片，并将采集单元数设置为10， 000。通过测量荧光珠的强度来调节FITC滤波电压，确保两个连续实验之间珠子强度的相对差异不超过5%用双蒸水洗涤机器几秒钟以去除任何可能的多余珠子。测量样品荧光强度并单击预览，同时等待三到五秒钟以获得样品进样稳定性。
最后点击获取。在实验结束时再次测量珠子。检查两颗磁珠测量值的相对差值是否超过5%后，将FACS数据导出为FCS文件。
打开 R 工作室并加载脚本BDverse_analysis。R 来分析 FCS 文件。将实验名称设置为 ename，将 FCS 文件存储为dir_d的目录路径，并将结果文件创建为dir_r。
接下来，设置荧光通道。设置已测量的样本数。条形图和箱形图的点图的尺寸以及 x 轴和 y 轴的最大长度。
通过从相应行中删除主题标签来选择评分方法。选择与所选门控方法和点图分辨率相对应的 flowSet 对象门控，该分辨率应至少等于 256。取消注释两个过滤指令，以删除荧光为负的测量值，并删除由于手稿中描述的其他实验而导致的异常值。
按源并运行脚本。包含分析结果的所有文件都是在dir_r中创建的。当合成启动子上有6个lexOp靶位点时，dSpCas9-VP64的活化效率达到最佳。
而对于dCas12a-VPR而言，当将三个拷贝的lexOp插入合成启动子中时，激活效率最高。位于整合质粒上的CRISPR RNA和单向导RNA的活化率比放置在游离质粒上的活化率高1.4至2.4倍，高1.1至1.5倍。RT-qPCR结果表明，无论表达系统如何，游离体载体产生的单向导RNA CRISPR RNA水平都高于整合载体。
测试了复合物dSpCas9和支架RNA募集MCP-VP64的活化效率。含有单一野生型和F6MS2发夹的支架RNA分别具有5.27倍和4.3倍的活化。然而，两种发夹的组合产生了7.54倍的活化效率。
使用四种不同的启动子来驱动三种二型抗CRISPR的表达，表明它们以剂量依赖性方式起作用。强启动子将荧光水平分别降低到其值的0.21、0.11和0.13。滴定曲线显示，该回路的行为类似于打结步态，开关比接近2.3。
研究了五型抗CRISPR A 1将denAS-Cas12a和dLB-Cas12a作为激活剂的荧光表达从19%降低到71%其中，当pGAL1在pTEF1和遗传CYC1t-pCYC1noTata 5型抗CRISPR-A1下产生时，Acr-VA的性能波动较大。FACS机器很脆弱，因此应小心处理。细胞溶液不应太稠密，机器应保持清洁。
