يسمح هذا البروتوكول بعزل المركبات من الرخويات ذات الخصائص المضادة للمكورات العقدية. تقدم هذه التقنية نهجا غير متحيز لتحديد وعزل المركبات من الرخويات ذات الخصائص المحتملة ، بما في ذلك قتل مسببات الأمراض الفطرية البشرية. هناك مركبات أخرى ، مثل مثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية ، تستخدم لعلاج مرضى فيروس نقص المناعة البشرية.
ومع ذلك ، فإن التوسع في مسببات الأمراض الأخرى ، وكذلك التحقيق في المصادر الطبيعية ، يمثل طرقا جديدة للاكتشاف. الخطوة الأخيرة هي أصعب خطوة حيث قد لا تتم تصفية العينات. نتيجة لذلك ، قد تحتاج العينات إلى التخفيف للتصفية.
ابدأ بجمع الرخويات مثل Cipangopaludina chinensis من منطقة طبيعية محددة ومعتمدة. حدد الأنواع المحلية والغازية لتقييم مجموعة واسعة من الآثار المضادة للفطريات المحتملة. كسر بلطف قذيفة C.chinensis باستخدام مدقة وقذائف الهاون وإزالة القطع الصلبة مع زوج من الملقط.
بشكل عام ، يتم تجميع 10 رخويات للبروتوكول. اجمع ووزن ما يقرب من 15 إلى 20 جراما من العينة واستخدم المقص لتقطيع الأعضاء إلى قطع صغيرة بحجم 0.5 إلى سنتيمتر واحد تقريبا. قم بتجميد عينات الأعضاء المقطعة والمقطوعة باستخدام النيتروجين السائل قبل طحن عينات الأعضاء إلى مسحوق ناعم باستخدام مدقة وقذائف هاون.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف ما يقرب من 15 جراما من مسحوق عينة العضو إلى 30 ملليلتر من الماء المقطر البارد لتحقيق نسبة واحد إلى اثنين. صب ملليلتر من العينة في أنابيب ملليلتر عالية التأثير وأضف ما يقرب من 500 ميكروغرام من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ثلاثة ملليمترات إلى كل أنبوب. تجانس لمدة ثلاث دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة في أربع درجات مئوية باستخدام خلاط رصاصة أو مضرب حبة.
جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 12،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر وتخلص من الحبيبات. قم بتصفية تعقيم المادة الطافية باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر وتخزين العينات على الثلج قبل توضيح المستخلص.
ضع العينة الطافية في حمام حراري على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وقم بتبريدها على الفور عن طريق نقل العينة إلى دلو مملوء بالثلج لمدة 20 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي العينات الباردة في 15،000 غرام لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر وتخلص من الحبيبات.
قم بتعقيم العينات باستخدام مرشح غشاء 0.22 ميكرون ثم قم بتخزينها على الجليد. بمجرد الانتهاء من ذلك ، حدد تركيز البروتين في الخام والمستخلصات الموضحة باستخدام مقايسة القياس الكمي. نطاق تركيز البروتين الأمثل هو أربعة إلى ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر.
احتضان العينات على الجليد لمدة تصل إلى ساعة واحدة أو تجميدها في النيتروجين السائل قبل تخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة. في صفيحة قاع مسطحة مكونة من 96 بئرا ، احتضن 10 ميكرولتر من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر من مستخلص بروتين الرخويات الخام أو المصفى ، و 10 ميكرولتر من subtilisin A ، بتركيز ضمن النطاق الخطي المقاس ، و 220 ميكرولتر من 100 مليمولار تريس هيدروكلوريد من 8.6 درجة حموضة لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. ثم أضف 10 ميكرولتر من N-succinyl-alanine ، ألانين ، برولين ، فينولالانين ، p-nitroaniline ، الركيزة ل subtilisin A ، بتركيز نهائي يبلغ كم واحد لحجم تفاعل نهائي يبلغ 250 ميكرولتر.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بقياس النشاط الأنزيمي من خلال مراقبة الكثافة البصرية عند 405 نانومتر كل 15 ثانية لمدة ثلاث دقائق. تأكد من أن الآبار التي لا تحتوي على مقتطفات تنتج منحنى مستقيم أثناء القراءة. لتحديد النشاط الأنزيمي المتبقي ، احسب نسبة النشاط الأنزيمي في وجود مستخلص الرخويات إلى ذلك في حالة عدم وجود المستخلص.
إذا لوحظ نشاط مثبط ، قم بقياس قيمة التركيز المثبط 50 أو IC50 باستخدام مجموعة من تركيزات المستخلصات. أدخل مستعمرة واحدة من النوع البري C.neoformans H99 في خمسة ملليلتر من مستخلص الخميرة بيبتون دكستروز أو وسط YEPD باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر واحتضانها لمدة 16 إلى 18 ساعة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. اجمع 500 ميكرولتر من الثقافة في كوفيت وقم بقياس النمو من خلال قراءة الكثافة البصرية عند 600 نانومتر.
تمييع الثقافة مع قاعدة نيتروجين الخميرة أو وسط YNB إلى كثافة بصرية نهائية تبلغ 0.02. شارك في زراعة خلايا C.neoformans بتركيزات مختلفة من المستخلصات الخام والموضحة عن طريق خلط 10 ميكرولتر من المستخلصات مع 190 ميكرولتر من ثقافة C.neoformans المخففة في صفيحة 96 بئرا. قم بقياس النمو من خلال قراءة الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر باستخدام قارئ لوحة كل 15 دقيقة إلى ساعة واحدة لمدة 72 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
كانت مقتطفات C.chinensis قادرة على تثبيط النشاط المحلل للبروتين من subtilisin A ، والذي يرتبط بالفوعة في Cryptococcus neoformans بقيمة IC50 تبلغ 5.3 ميكروغرام لكل ملليلتر في المستخلصات الخام و 4.53 ميكروغرام لكل ملليلتر في المستخلصات الموضحة. أظهر تقييم مستخلصات C.chinensis مقابل العمليات المرتبطة بإنتاج عامل ضراوة C.Neoformans بما في ذلك نمو الفطريات ، أن هناك انخفاضا كبيرا في نمو الفطريات عند 37 درجة مئوية في وجود مستخلصات C.chinensis الخام والموضحة. أظهر تقييم المستخلصات مقابل الكبسولة وإنتاج الميلانين وتكوين الأغشية الحيوية أنه لا توجد تغييرات في إنتاج الكبسولات أو الميلانين في وجود مستخلصات C.chinensis الخام أو الموضحة.
ومع ذلك، لوحظ انخفاض كبير بنسبة 70 إلى 80٪ في تكوين الأغشية الحيوية عند تركيزات عالية من المستخلصات الخام والموضحة مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة. يعتمد نجاح البروتوكول على إجراء الاستخراج المناسب بما في ذلك الطحن وإضافة الكمية المناسبة من الإنزيم والقراءة فقط بعد إضافة الركيزة. تركز هذه التقنية على التحمل الحراري كعامل ضراوة مهم للمكورات العقدية.
ومع ذلك ، يمكن تقييم عوامل الفوعة الأخرى مثل إنتاج الميلانين والكبسولات ، وكذلك تكوين الأغشية الحيوية. تفتح هذه النتائج مسارات جديدة تشكل مناهج جديدة للاستراتيجيات المضادة للفطريات باستخدام المركبات الطبيعية التي توفر مزيدا من الاستقرار والنوعية وأقل عرضة للمقاومة. الهدف على المدى الطويل هو إيجاد طرق جديدة ضد مسببات الأمراض الفطرية هذه وتقليل آليات المقاومة.
