이 프로토콜은 항 크립토 코카인 특성을 가진 연체 동물로부터 화합물을 분리 할 수 있습니다. 이 기술은 인간 곰팡이 병원체를 죽이는 것을 포함하여 잠재적인 특성을 가진 연체동물에서 화합물을 식별하고 분리하는 편견 없는 접근 방식을 제공합니다. HIV 프로테아제 억제제와 같은 다른 화합물이 HIV 환자를 치료하는 데 사용됩니다.
그러나 다른 병원체로의 확장과 천연 자원 조사는 새로운 발견의 길을 나타냅니다. 마지막 단계는 샘플이 필터링되지 않을 수 있으므로 가장 어려운 단계입니다. 결과적으로 필터링을 위해 샘플을 희석해야 할 수 있습니다.
지정되고 승인된 자연 지역에서 Cipangopaludina chinensis와 같은 연체동물을 수집하는 것으로 시작하십시오. 광범위한 잠재적 항진균 효과를 평가하기 위해 토착 및 침입 종을 선택하십시오. 유봉과 박격포를 사용하여 C.chinensis의 껍질을 부드럽게 부수고 핀셋으로 단단한 조각을 제거합니다.
일반적으로 프로토콜을 위해 10개의 연체동물이 풀링됩니다. 약 15-20 그램의 샘플을 수집하고 무게를 측정하고 가위를 사용하여 장기를 약 0.5-1 센티미터 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 유봉과 모르타르를 사용하여 장기 샘플을 미세 분말로 분쇄하기 전에 액체 질소를 사용하여 해부하고 절단한 장기 샘플을 급속 동결합니다.
완료되면 약 15g의 장기 샘플 분말을 30ml의 차가운 증류수에 첨가하여 1:2의 비율을 얻습니다. 2 밀리리터의 샘플을 고 임팩트 2 밀리리터 튜브에 붓고 약 500 마이크로 그램의 3 밀리미터 스테인리스 스틸 비드를 각 튜브에 추가합니다. 불릿 블렌더 또는 비드 비터를 사용하여 섭씨 4도에서 1, 200 RPM으로 3 분 동안 균질화합니다.
튜브를 섭씨 4도에서 20 분 동안 12, 000 G에서 원심 분리합니다. 신선한 50 밀리리터 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다. 0.22 마이크로 미터 멤브레인을 사용하여 상청액을 여과하고 추출물을 정화하기 전에 샘플을 얼음에 보관하십시오.
상청액 샘플을 섭씨 60도의 열조에 30분 동안 넣고 샘플을 얼음으로 채워진 양동이에 20분 동안 옮겨 즉시 식힙니다. 차가운 샘플을 섭씨 4도에서 45 분 동안 15, 000 G에서 원심 분리합니다. 신선한 50 밀리리터 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다.
필터는 0.22 미크론 멤브레인 필터를 사용하여 샘플을 멸균 한 다음 얼음에 보관합니다. 완료되면 정량 분석을 사용하여 원유 및 정제된 추출물의 단백질 농도를 결정합니다. 최적의 단백질 농도 범위는 밀리리터당 4-8마이크로그램입니다.
샘플을 얼음 위에서 최대 1시간 동안 배양하거나 액체 질소에서 급속 냉동한 후 필요할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 96웰 편평한 바닥 플레이트에서, 밀리리터당 4밀리그램의 미정제 또는 정제된 연체동물 단백질 추출물 10마이크로리터, 측정된 선형 범위 내의 농도를 갖는 서브틸리신 A 10마이크로리터, 및 섭씨 25도에서 10분 동안 pH 8.6의 100밀리몰 트리스 염산염 220마이크로리터를 배양한다. 그런 다음 서브 틸리 신 A의 기질 인 N- 석시 닐 알라닌, 알라닌, 프롤린, 페놀알라닌, p- 니트로 아닐린 10 마이크로 리터를 최종 반응 부피 250 마이크로 리터에 대해 1KM의 최종 농도로 첨가한다.
완료되면 3분 동안 15초마다 405나노미터의 광학 밀도를 모니터링하여 효소 활성을 측정합니다. 판독하는 동안 추출물이 없는 웰이 직선 곡선을 생성하는지 확인하십시오. 잔류 효소 활성을 결정하기 위해, 연체 동물 추출물의 존재 하에서의 효소 활성과 추출물의 부재 시의 효소 활성의 비율을 계산한다.
저해 활성이 관찰되는 경우, 추출물의 농도 범위를 이용하여 저해 농도 50 또는 IC50 값을 측정한다. 10 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 5밀리리터의 효모 추출물, 펩톤, 포도당 또는 YEPD 배지에 C.neoformans H99 야생형의 단일 콜로니를 도입하고 섭씨 30도 및 200RPM에서 16-18시간 동안 배양합니다. 큐벳에 500 마이크로 리터의 배양 물을 수집하고 600 나노 미터에서 광학 밀도를 판독하여 성장을 측정합니다.
배양물을 효모 질소 염기 또는 YNB 배지로 최종 광학 밀도 0.02로 희석한다. 96웰 플레이트에서 10마이크로리터의 추출물과 희석된 C.neoformans 배양물 190마이크로리터를 혼합하여 다양한 농도의 미정제 및 정제된 추출물을 갖는 C.neoformans 세포를 공동 배양합니다. 200 RPM 및 섭씨 37도에서 72시간 동안 15분 내지 1시간 간격으로 플레이트 리더를 이용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 판독하여 성장을 측정하였다.
C.chinensis의 추출물은 크립토 코커스 네오 포르 만스의 독성과 관련된 서브 틸리 신 A의 단백질 분해 활성을 억제 할 수 있었으며, IC50 값은 조 추출물에서 밀리 리터당 5.3 마이크로 그램, 정제 추출물에서 밀리 리터당 4.53 마이크로 그램입니다. 곰팡이 성장을 포함하여 C.Neoformans 독성 인자 생산과 관련된 과정에 대한 C.chinensis 추출물의 평가는 원유 및 정제된 C.chinensis 추출물의 존재 하에 섭씨 37도에서 곰팡이 성장이 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 캡슐, 멜라닌 생성 및 생물막 형성에 대한 추출물의 평가는 조잡하거나 정제된 C.chinensis 추출물의 존재 하에서 캡슐 또는 멜라닌 생성에 변화가 없음을 보여주었습니다.
그러나, 생물막 형성에서 70 내지 80%의 현저한 감소가 처리되지 않은 대조군에 비해 고농도의 조잡하고 정제된 추출물에서 관찰되었다. 프로토콜의 성공 여부는 분쇄, 적절한 양의 효소 첨가 및 기질 첨가 후 판독을 포함한 적절한 추출 절차에 달려 있습니다. 이 기술은 중요한 크립토코커스 독성 인자로서 열 내성에 중점을 둡니다.
그러나 멜라닌 및 캡슐 생성, 생물막 형성과 같은 다른 독성 인자를 평가할 수 있습니다. 이러한 결과는 더 많은 안정성, 특이성을 제공하고 내성이 적은 천연 화합물을 사용하는 항진균 전략에 대한 새로운 접근 방식을 구성하는 새로운 경로를 열어줍니다. 장기적인 목표는 이러한 곰팡이 병원체에 대한 새로운 방법을 찾고 저항성 메커니즘을 최소화하는 것입니다.
