Bu protokol, bileşiklerin yumuşakçalardan anti-kriptokok özelliklerine sahip izolasyonuna izin verir. Bu teknik, insan mantar patojenlerini öldürmek de dahil olmak üzere potansiyel özelliklere sahip yumuşakçalardan bileşikleri tanımlamak ve izole etmek için tarafsız bir yaklaşım sunar. HIV hastalarını tedavi etmek için kullanılan HIV proteaz inhibitörleri gibi başka bileşikler de vardır.
Bununla birlikte, diğer patojenlere genişlemenin yanı sıra doğal kaynakların araştırılması, yeni keşif yollarını temsil eder. Son adım, numuneler filtrelenemeyeceğinden en zor adımdır. Sonuç olarak, numunelerin filtreleme için seyreltilmesi gerekebilir.
Cipangopaludina chinensis gibi yumuşakçaları belirlenmiş ve onaylanmış bir doğal alandan toplayarak başlayın. Çok çeşitli potansiyel antifungal etkileri değerlendirmek için yerli ve istilacı türleri seçin. Bir havane ve harç kullanarak C.chinensis'in kabuğunu yavaşça kırın ve katı parçaları bir çift cımbızla çıkarın.
Genel olarak, protokol için 10 yumuşakça toplanır. Numunenin yaklaşık 15 ila 20 gramını toplayın ve tartın ve organları yaklaşık 0,5 ila bir santimetre büyüklüğünde küçük parçalara ayırmak için makas kullanın. Organ numunelerini havaneli ve harç kullanarak ince bir toz haline getirmeden önce disseke edilmiş ve kesilmiş organ numunelerini sıvı azot kullanarak flaş dondurun.
Bir kez yapıldıktan sonra, bir ila iki oranında bir oran elde etmek için 30 mililitre soğuk damıtılmış suya yaklaşık 15 gram organ numunesi tozu ekleyin. Numunenin iki mililitresini yüksek darbeli iki mililitrelik tüplere dökün ve her tüpe yaklaşık 500 mikrogram üç milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Bir mermi karıştırıcı veya boncuk çırpıcı kullanarak dört santigrat derecede 1.200 RPM'de üç dakika homojenize edin.
Tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve peleti atın. Filtre, süpernatantı 0.22 mikrometrelik bir membran kullanarak sterilize edin ve ekstraktı berraklaştırmadan önce numuneleri buz üzerinde saklayın.
Süpernatant numuneyi 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede bir termal banyoya yerleştirin ve numuneyi 20 dakika boyunca buzla dolu bir kovaya aktararak hemen soğutun. Soğuk numuneleri dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 15.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve peleti atın.
Filtre, 0,22 mikronluk bir membran filtre kullanarak numuneleri sterilize edin ve ardından buz üzerinde saklayın. Bir kez yapıldıktan sonra, ham maddedeki protein konsantrasyonunu ve bir niceleme testi kullanarak berraklaştırılmış ekstraktları belirleyin. En uygun protein konsantrasyon aralığı, mililitre başına dört ila sekiz mikrogramdır.
Numuneleri buz üzerinde bir saate kadar inkübe edin veya ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce sıvı azotta dondurun. 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakada, mililitre ham veya berraklaştırılmış yumuşakça proteini ekstraktı başına 10 mikrolitre dört miligram, ölçülen doğrusal aralıkta bir konsantrasyona sahip 10 mikrolitre subtilisin A ve 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.6 pH'lık 220 mikrolitre 100 milimolar tris hidroklorür inkübe edin. Daha sonra, 250 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi için bir KM'lik son konsantrasyonda, 10 mikrolitre N-süksinil-alanin, alanin, prolin, fenolalanin, p-nitroanilin, subtilisin A substratı ekleyin.
Bir kez bittiğinde, optik yoğunluğu üç dakika boyunca her 15 saniyede bir 405 nanometrede izleyerek enzimatik aktiviteyi ölçün. Ekstrakt içermeyen kuyucukların okuma sırasında düz bir eğri ürettiğinden emin olun. Artık enzimatik aktiviteyi belirlemek için, yumuşakça ekstraktının varlığında enzimatik aktivitenin, ekstraktın yokluğunda buna oranını hesaplayın.
İnhibitör aktivite gözlenirse, ekstraktların bir dizi konsantrasyonunu kullanarak inhibitör konsantrasyon 50 veya IC50 değerini ölçün. 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak beş mililitre maya özü pepton dekstroz veya YEPD ortamına tek bir C.neoformans H99 yabani tip koloni ekleyin ve 30 santigrat derece ve 200 RPM'de 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin. Bir küvette kültürün 500 mikrolitresini toplayın ve 600 nanometrede optik yoğunluğu okuyarak büyümeyi ölçün.
Kültürü maya azot tabanı veya YNB ortamı ile 0,02'lik son optik yoğunluğa kadar seyreltin. Ko-kültür C.neoformans hücreleri, 10 mikrolitre ekstraktın 190 mikrolitresi ile seyreltilmiş C.neoformans kültürünün 190 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir plakada karıştırarak farklı konsantrasyonlarda ham ve berraklaştırılmış ekstraktlara sahiptir. 200 RPM ve 37 santigrat derecede 72 saat boyunca her 15 dakikada bir ila bir saatte bir plaka okuyucu kullanarak 600 nanometrede optik yoğunluğu okuyarak büyümeyi ölçün.
C.chinensis ekstraktları, ham ekstraktlarda mililitre başına 5.3 mikrogram IC50 değeri ve berraklaştırılmış ekstraktlarda mililitre başına 4.53 mikrogram olan Cryptococcus neoformans'ta virülans ile ilişkili subtilisin A'nın proteolitik aktivitesini inhibe edebildi. C.chinensis ekstraktlarının mantar büyümesi de dahil olmak üzere C.Neoformans virülans faktörü üretimi ile ilişkili süreçlere karşı değerlendirilmesi, ham ve berraklaştırılmış C.chinensis ekstraktlarının varlığında 37 santigrat derecede mantar büyümesinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ekstraktların kapsül, melanin üretimi ve biyofilm oluşumuna karşı değerlendirilmesi, ham veya berraklaştırılmış C.chinensis ekstraktlarının varlığında kapsül veya melanin üretiminde herhangi bir değişiklik olmadığını göstermiştir.
Bununla birlikte, biyofilm oluşumunda% 70 ila% 80'lik önemli bir azalma, işlenmemiş kontrole göre ham ve berraklaştırılmış ekstraktların yüksek konsantrasyonlarında gözlenmiştir. Protokol başarısı, öğütme, uygun miktarda enzimin eklenmesi ve substratın eklenmesinden hemen sonra okuma dahil olmak üzere uygun ekstraksiyon prosedürüne bağlıdır. Teknik, önemli bir kriptokokal virülans faktörü olarak termal toleransa odaklanmaktadır.
Bununla birlikte, melanin ve kapsül üretimi ve biyofilm oluşumu gibi diğer virülans faktörleri değerlendirilebilir. Bu sonuçlar, daha fazla stabilite, özgüllük sunan ve dirence daha az eğilimli olan doğal bileşikleri kullanarak antifungal stratejiler üzerinde yeni yaklaşımlar oluşturan yeni yollar açmaktadır. Uzun vadeli hedef, bu mantar patojenlerine karşı yeni yöntemler bulmak ve direnç mekanizmalarını en aza indirmektir.
