פרוטוקול זה מאפשר בידוד של תרכובות מרכיכות בעלות תכונות אנטי-קריפטוקוקיות. טכניקה זו מציעה גישה בלתי משוחדת לזיהוי ולבידוד תרכובות מרכיכות בעלות תכונות פוטנציאליות, כולל הריגת הפתוגנים הפטרייתיים האנושיים. ישנן תרכובות אחרות, כגון מעכבי פרוטאז HIV, המשמשים לטיפול בחולי HIV.
עם זאת, התרחבות לפתוגנים אחרים, כמו גם חקירת מקורות טבעיים, מייצגים כיווני גילוי חדשים. השלב האחרון הוא השלב הקשה ביותר מכיוון שהדגימות עשויות שלא לעבור סינון. כתוצאה מכך, ייתכן שיהיה צורך לדלל דגימות לצורך סינון.
התחילו באיסוף רכיכות כמו Cipangopaludina chinensis מאזור טבעי ייעודי ומאושר. בחר מינים מקומיים ופולשים כדי להעריך מגוון רחב של השפעות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות. שוברים בעדינות את הקליפה של C.chinensis באמצעות מזיק וטיט ולהסיר את החתיכות המוצקות עם זוג פינצטה.
בדרך כלל, 10 רכיכות מאוגדות עבור הפרוטוקול. לאסוף ולשקול כ 15 עד 20 גרם של הדגימה ולהשתמש מספריים לחתוך את האיברים לחתיכות קטנות בערך 0.5 עד סנטימטר אחד בגודל. יש להקפיא את דגימות האיברים שנותחו ולחתוך אותן באמצעות חנקן נוזלי לפני טחינת דגימות האיברים לאבקה דקה באמצעות חומר מליטה ומליטה.
לאחר שתסיים, הוסף כ -15 גרם של אבקת דגימת איברים ל -30 מיליליטר מים מזוקקים קרים כדי להשיג יחס של אחד לשניים. יוצקים שני מיליליטר של הדגימה לתוך צינורות שני מיליליטר השפעה גבוהה ולהוסיף כ 500 מיקרוגרם של שלושה מילימטרים חרוזי נירוסטה לכל צינור. הומוגניזציה במשך שלוש דקות ב 1, 200 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס באמצעות בלנדר כדורים או מקציף חרוזים.
צנטריפוגה הצינור ב 12, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנאטנט בצינור טרי של 50 מיליליטר ומשליכים את הכדורית. מסננים לעקר את הסופרנאטנט באמצעות קרום של 0.22 מיקרומטר ומאחסנים את הדגימות על קרח לפני הבהרת התמצית.
הניחו את דגימת הסופרנאטנט באמבט תרמי בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומיד קררו אותה על ידי העברת הדגימה לדלי מלא קרח למשך 20 דקות. צנטריפוגה דגימות קר ב 15, 000 גרם במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנאטנט בצינור טרי של 50 מיליליטר ומשליכים את הכדורית.
סנן לעקר את הדגימות באמצעות מסנן קרום 0.22 מיקרון ולאחר מכן לאחסן אותם על קרח. לאחר שתסיים, קבע את ריכוז החלבון בנפט הגולמי ואת התמציות המזוקקות באמצעות בדיקת כימות. טווח ריכוז החלבון האופטימלי הוא ארבעה עד שמונה מיקרוגרם למיליליטר.
יש לדגור על הדגימות על קרח עד שעה או להקפיא בחנקן נוזלי לפני אחסונן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לצורך. בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות, לדגור על 10 מיקרוליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר תמצית חלבון רכיכות גולמי או מזוקק, 10 מיקרוליטר של subtilisin A, בעל ריכוז בטווח ליניארי נמדד, ו 220 מיקרוליטר של 100 מילימולרי tris hydrochloride של 8.6 pH במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של N-succinyl-alanine, alanine, proline, phenolalanine, p-nitroaniline, המצע עבור subtilisin A, בריכוז סופי של קילומטר אחד עבור נפח תגובה סופי של 250 מיקרוליטר.
לאחר שתסיים, מדוד את הפעילות האנזימטית על ידי ניטור הצפיפות האופטית ב 405 ננומטר כל 15 שניות במשך שלוש דקות. ודא כי הבארות ללא תמציות לייצר עקומה ישרה במהלך הקריאה. כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית השיורית, חשב את היחס בין הפעילות האנזימטית בנוכחות תמצית רכיכות לזו שבהיעדר התמצית.
אם נצפתה פעילות מעכבת, מדדו את הריכוז המעכב 50 או ערך IC50 באמצעות טווח ריכוזים של התמציות. הכניסו מושבה אחת של C.neoformans H99 מסוג בר לחמישה מיליליטר של תמצית שמרים, פפטון, דקסטרוז או מדיום YEPD באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר ודגרו במשך 16 עד 18 שעות ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. אספו 500 מיקרוליטר של התרבית בקובט ומדדו את הגידול על ידי קריאת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.
לדלל את התרבית עם בסיס חנקן שמרים או מדיום YNB לצפיפות אופטית סופית של 0.02. תרבית משותפת של תאי C.neoformans עם ריכוזים שונים של תמציות גולמיות ומזוקקות על ידי ערבוב 10 מיקרוליטר של התמציות עם 190 מיקרוליטר של תרבית C.neoformans מדוללת בצלחת של 96 בארות. מדוד את הגידול על ידי קריאת הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר באמצעות קורא לוחות כל 15 דקות עד שעה למשך 72 שעות ב- 200 סל"ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
התמציות של C.chinensis הצליחו לעכב את הפעילות הפרוטאוליטית של subtilisin A, אשר קשורה לאלימות ב Cryptococcus neoformans עם ערך IC50 של 5.3 מיקרוגרם למיליליטר בתמציות גולמיות ו 4.53 מיקרוגרם למיליליטר בתמציות מזוקקות. ההערכה של תמציות C.chinensis מול תהליכים הקשורים לייצור גורם אלימות C.Neoformans כולל צמיחה פטרייתית, הראתה כי חלה ירידה משמעותית בצמיחת פטריות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות תמציות C.chinensis גולמיות ומזוקקות. הערכת התמציות כנגד ייצור קפסולות, מלנין והיווצרות ביופילמים הראתה כי לא היו שינויים בייצור קפסולות או מלנין בנוכחות תמציות C.chinensis גולמיות או מזוקקות.
עם זאת, נצפתה ירידה משמעותית של 70% עד 80% בהיווצרות ביופילם בריכוזים גבוהים של תמציות גולמיות והבהרות ביחס לביקורת שלא טופלה. הצלחת הפרוטוקול תלויה בהליך מיצוי נכון הכולל טחינה, הוספת כמות מתאימה של אנזים וקריאה בלבד לאחר הוספת המצע. הטכניקה מתמקדת בסבילות תרמית כגורם אלימות קריפטוקוקלי חשוב.
עם זאת, ניתן להעריך גורמי אלימות אחרים כגון ייצור מלנין וכמוסות, כמו גם היווצרות ביופילם. תוצאות אלה פותחות נתיבים חדשים המהווים גישות חדשות לאסטרטגיות אנטי פטרייתיות באמצעות תרכובות טבעיות המציעות יותר יציבות, ספציפיות ומועדות פחות לעמידות. המטרה ארוכת הטווח היא למצוא שיטות חדשות נגד פתוגנים פטרייתיים אלה ולמזער מנגנוני התנגדות.
