Этот протокол позволяет выделять из моллюсков соединения с антикриптококковыми свойствами. Этот метод предлагает непредвзятый подход к выявлению и выделению соединений из моллюсков с потенциальными свойствами, включая уничтожение грибковых патогенов человека. Существуют и другие соединения, такие как ингибиторы протеазы ВИЧ, которые используются для лечения пациентов с ВИЧ.
Тем не менее, экспансия на другие патогены, а также исследование природных источников представляют собой новые пути открытий. Последний шаг является самым сложным этапом, так как образцы могут не быть отфильтрованы. В результате может потребоваться разбавление образцов для фильтрации.
Начните со сбора моллюсков, таких как Cipangopaludina chinensis, на специально отведенной и утвержденной природной территории. Выберите местные и инвазивные виды, чтобы оценить широкий спектр потенциальных противогрибковых эффектов. Аккуратно разбейте оболочку C.chinensis с помощью пестика и ступки и удалите твердые кусочки пинцетом.
Как правило, для протокола объединяется 10 моллюсков. Соберите и взвесьте примерно от 15 до 20 граммов образца и с помощью ножниц разрежьте органы на мелкие кусочки размером примерно от 0,5 до одного сантиметра. Мгновенно заморозьте препарированные и разрезанные образцы органов с использованием жидкого азота, а затем измельчите образцы органов в мелкий порошок с помощью пестика и ступки.
После этого добавьте примерно 15 граммов порошка образца органа в 30 миллилитров холодной дистиллированной воды, чтобы достичь соотношения один к двум. Налейте два миллилитра образца в ударопрочные двухмиллилитровые пробирки и добавьте примерно 500 микрограммов трехмиллиметровых шариков из нержавеющей стали в каждую пробирку. Гомогенизируйте в течение трех минут при 1 200 об/мин при четырех градусах Цельсия с помощью блендера или бисера.
Центрифугируйте пробирку при 12 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в свежую 50-миллилитровую пробирку и выбросьте гранулы. Фильтр стерилизует надосадочную жидкость с помощью мембраны 0,22 микрометра и хранит образцы на льду до осветления экстракта.
Поместите образец надосадочной жидкости в термальную ванну при температуре 60 градусов Цельсия на 30 минут и сразу же охладите его, переложив образец в ведро, наполненное льдом, на 20 минут. Центрифугируют холодные образцы при 15 000 г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в свежую 50-миллилитровую пробирку и выбросьте гранулы.
Фильтр стерилизует образцы с помощью мембранного фильтра 0,22 микрона, а затем хранит их на льду. После этого определите концентрацию белка в сыром сырье и осветленных экстрактах с помощью количественного анализа. Оптимальный диапазон концентрации белка составляет от четырех до восьми микрограммов на миллилитр.
Инкубируйте образцы на льду до одного часа или заморозьте в жидком азоте, прежде чем хранить их при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. В 96-луночной пластине с плоским дном инкубируйте 10 микролитров по четыре миллиграмма на миллилитр сырого или осветленного белкового экстракта моллюска, 10 микролитров субтилизина А, имеющего концентрацию в пределах измеренного линейного диапазона, и 220 микролитров 100 миллимолярного триса гидрохлорида 8,6 рН в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. Затем добавляют 10 микролитров N-сукцинил-аланина, аланина, пролина, фенолаланина,-нитроанилина, субстрата для субтилизина А, в конечной концентрации один км для конечного объема реакции 250 микролитров.
После этого измерьте ферментативную активность, контролируя оптическую плотность на уровне 405 нанометров каждые 15 секунд в течение трех минут. Убедитесь, что скважины без экстрактов дают прямую кривую во время считывания. Чтобы определить остаточную ферментативную активность, рассчитайте отношение ферментативной активности в присутствии экстракта моллюска к таковой при отсутствии экстракта.
Если наблюдается ингибирующая активность, измерьте значение ингибирующей концентрации 50 или IC50, используя диапазон концентраций экстрактов. Введите одну колонию C.neoformans H99 дикого типа в пять миллилитров дрожжевого экстракта, пептон-декстрозы или среды YEPD, используя наконечник пипетки объемом 10 микролитров, и инкубируйте в течение 16-18 часов при 30 градусах Цельсия и 200 об/мин. Соберите 500 микролитров культуры в кювету и измерьте рост, считывая оптическую плотность на 600 нанометрах.
Разбавляют культуру дрожжевым азотным основанием или средой YNB до конечной оптической плотности 0,02. Совместное культивирование клеток C.neoformans с различными концентрациями сырых и осветленных экстрактов путем смешивания 10 микролитров экстрактов со 190 микролитрами разбавленной культуры C.neoformans в 96-луночном планшете. Измерьте рост, считывая оптическую плотность на 600 нанометрах с помощью считывателя пластин каждые 15 минут до одного часа в течение 72 часов при 200 об / мин и 37 градусах Цельсия.
Экстракты C.chinensis были способны ингибировать протеолитическую активность субтилизина А, которая связана с вирулентностью у Cryptococcus neoformans со значением IC50 5,3 мкг на миллилитр в сырых экстрактах и 4,53 мкг на миллилитр в осветленных экстрактах. Оценка экстрактов C.chinensis против процессов, связанных с продукцией фактора вирулентности C.Neoformans, включая рост грибов, показала, что наблюдалось значительное снижение роста грибов при 37 градусах Цельсия в присутствии сырых и осветленных экстрактов C.chinensis. Оценка экстрактов против капсулы, продукции меланина и образования биопленок показала, что не было никаких изменений в продукции капсулы или меланина в присутствии сырых или осветленных экстрактов C.chinensis.
Однако значительное снижение образования биопленки на 70-80% наблюдалось при высоких концентрациях сырых и осветленных экстрактов по сравнению с необработанным контролем. Успех протокола зависит от правильной процедуры экстракции, включая измельчение, добавление соответствующего количества фермента и просто чтение после добавления субстрата. Метод фокусируется на термической толерантности как важном факторе вирулентности криптококка.
Однако можно оценить и другие факторы вирулентности, такие как производство меланина и капсул, а также образование биопленки. Эти результаты открывают новые пути, которые представляют собой новые подходы к противогрибковым стратегиям с использованием природных соединений, которые обеспечивают большую стабильность, специфичность и менее склонны к резистентности. Долгосрочная цель состоит в том, чтобы найти новые методы борьбы с этими грибковыми патогенами и свести к минимуму механизмы резистентности.
